Estudando a base neural do Comportamento Locomotor Adaptive em Insetos

1. A superfície de caminhada A superfície de caminhada preto é composto de duas placas de latão revestido de níquel permanentemente unidos, lado a lado e eletricamente isolados entre si por uma tira de dois milímetros de largura de 2 componentes cola epóxi (UHU plus, UHU GmbH, Alemanha), diretamente abaixo do eixo longitudinal do o animal. Eles produzem uma superfície total de 13.5×15.5cm (Figura 1). A separação dos planos metade para as pernas esquerda e direita permite a monitoração de contato tarsal independente para uma única perna em cada lado. A placa é lubrificada com uma mistura de glicerina / água na proporção de 95 partes de glicerina a 5 partes saturada de NaCl solução para transmitir escorregadio e condutividade elétrica; a viscosidade é de aproximadamente 430cStokes (Shankar e Kumar, 1994). A mistura é aplicada diretamente sobre a superfície e se dispersa com um pedaço de tecido mole para assegurar uma espessura total de 0,1 0,2 milímetros. 2. Setup Estimulação óptica Episódios andar são extraídas usando dois projetores, como descrito por Scharstein (1989) para projetar um padrão listrado em dois redondos, telas de vidro moído (diâmetro 130mm, telas Marata, Linos Photonics, Göttingen, Alemanha), que estão posicionados a uma distância de aprox. 70 milímetros dos olhos, e em um ângulo de 45 ° na parte frontal esquerda e à direita do prato (Fig.1). O comprimento de onda do padrão listrado é mantida constante em λ = 21 °. A freqüência de contraste de estímulos em movimento pode ser variado entre 0,35, 0,72, 1,07 e 1.49Hz. Desde a reação dos animais depende apenas da freqüência ω contraste / λ (ω = velocidade angular, λ = comprimento de onda padrão) se o contraste padrão é alto o suficiente (Fermi e Reichhardt, 1963), não variam ao longo do λ experimentos . A luminosidade da faixas brilhantes do lado do animal é de aproximadamente 15cd/m2 eo contraste 0,8. O olho composto do inseto stick (Carausius morosus) tem 24 omatídeos no eixo dorso-ventral (Friza, 1928) e um pouco mais no eixo rostro-caudal. Como o ângulo de divergência do olho de inseto vara é, em média, 6,2 ° (Jander e Volk-Henrichs, 1970) comprimento de onda padrão de nossa era de aproximadamente 4 vezes o ângulo do omatídeos. Os experimentos são criados em uma gaiola de Faraday escurecida e realizadas em uma sala escura de 20-22 ° C. Andar para a frente é induzida por um padrão progressivo em ambas as telas, onde as listras na tela de cada movimento para fora, ou um único feixe preto sobre fundo branco colocado entre as telas Turning é induzida por listras que se deslocam na mesma direção em ambas as telas. Não encontramos uma correlação entre a velocidade do movimento e listras o ângulo da curva. Uma vez luminância do padrão listrado está definido para induzir a pé, que geralmente não requer ajuste adicional, mas pode ser ajustado para diferentes animais de acordo com a necessidade pela tensão das lâmpadas halógenas nos projetores. 3. Preparando o animal Experimental Insetos adultos do sexo feminino stick (Carausius morosus) são coladas (cimento dental, ProTempII, a 3M ESPE, Seefeld, Alemanha), lado ventral para baixo em um pedaço de pau balsa fina (3x5x100mm, WxHxL), que é inserido em um tubo de bronze que tem vários conectores. O animal é mantido pressionado por aproximadamente um minuto até que a cola é pelo menos parcialmente endurecido. A cabeça e as pernas se projetam a partir da frente e do lado do pino para permitir a sua livre circulação. A área da coxas de todas as pernas, bem como a maior parte do abdômen tem que ser deixado livre de cola. Cabeça de inseto, tórax e nas extremidades distais de cada fêmur e tíbia são marcadas com pigmentos fluorescentes (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Alemanha) misturado com cimento dental para rastreamento de vídeo mais tarde. 4. Colocação de eletrodos EMG Atividade muscular dos músculos das pernas diferentes, tais como, neste exemplo, o transferidor e músculos coxas retrator, que estão localizados no tórax e protração causa (movimento para frente) e retração (movimento para trás) da perna, é registrado por meio de eletrodos EMG implantado no tórax. Todas as gravações são diferencialmente EMG amplificado. O sinal foi amplificado 100x em um pré-amplificador (eletrônica workshop, Zoological Institute, Colónia), band-pass filtrada, (100Hz-2000Hz), ainda mais ampliada (10x), e importado por meio de um conversor AD em Spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). Os eletrodos são feitos de fios de cobre revestido (Elektrisola, Eckernhagen, Alemanha; diâmetro externo 47μm). Para um eletrodo, dois fios são os primeiros untada com cola, então, os dois fios são trançados pegajosas em torno de si Em uma extremidade do fio torcido extremidades são soldadas a uma mini-ficha. Na outra ponta os fios são cortados para fornecer termina limpa sem isolamento para a inserção no animal. Os eletrodos EMG são Plugged no conector pequeno na extremidade do tubo de latão. Um pino Minuten é usada para fazer furos pequenos na cutícula As extremidades do corte do eletrodo são então separadas e inserido em um músculo em cerca de 1 milímetro de distância um do outro, que, em nossa experiência, dá um bom sinal-ruído. Cuidados devem ser tomados para não inserir os eletrodos muito profundo no músculo para evitar o seu dano. A Figura 2 mostra a localização dos eletrodos no tórax do animal. A Figura 3 mostra um animal com os fios de eletrodos no lugar. Usamos uma pequena gota de cola histoacrylic (3M Vetbond, St.Paul, Minnesota, EUA) para manter os fios no lugar. Um fio terra é inserida no abdômen. 5. Gravação do contato do tarso Contato do tarso é sempre gravado juntamente com traços EMG. Desde a superfície escorregadia é dividido em duas metades, um máximo de dois contralateral contatos tarsal pode ser registrado, ao mesmo tempo. Para este fim, a perna é usado como um "interruptor" para fechar um circuito entre a placa eo amplificador. Atual pode ser aplicado para as placas separadamente através de dois soquetes na base de cada prato. Podemos gerar dois sinais de onda quadrada com 2-4MV amplitudes com um gerador de pulsos (modelo MS501, eletrônica workshop, Zoological Institute, Colônia), que são de fase atrasada de 90 °. Os sinais são atenuados pela 60dB (/ 1000) e aplicado a as duas metades da superfície escorregadia. Neste experimento utilizamos apenas um dos dois sinais. É, simultaneamente, alimentados em uma fechadura-em-amplificador como um sinal de referência. O lock-in-amplificador de 2 fases (eletrônica workshop, Zoological Institute, Colónia) seletivamente apenas amplifica os sinais da mesma freqüência e fase do sinal de referência fornecidos. Um segundo canal só detecta o sinal de fase de 90 ° atrasada. Sinais de ruído de frequências de frequência de referência são rejeitadas e não afetam a medição. O sinal de saída do amplificador é alimentado em um conversor AD (Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK) e Spike2 usando digitalizadas. Entre touch-down e levante-off do tarso para e da superfície escorregadia, a corrente flui através da placa de tarso e tíbia para o fio de cobre (ver abaixo: 5,3-5,8). O amplificador escolhido tem uma resistência de entrada elevada (1MΩ) eo sinal de tensão é muito pequena, a fim de evitar afetar o comportamento pé do animal. A passagem de corrente através tarso e tíbia é entre 2 e 4NA. O tempo de espera do sinal durante a touch-down, entre a entrada em que o lubrificante ea superfície de contato é menor que 1 ms. A transição do sinal de contato durante a decolagem é menos íngreme e mais atrasado. Isto é devido à ruptura atrasada do lubrificante do tarso por um efeito de ascensão capilar e devido ao movimento da perna, sem completar a decolagem em fase de balanço. O tubo de bronze com o pau de balsa para o qual o animal é colado é inserido em um micromanipulador para permitir o ajuste da altura do animal, entre 7 e 12 milímetros acima da superfície escorregadia, o que corresponde à altura durante a caminhada livre. Para medir o fluxo de corrente sempre que o tarso inseto da perna é monitorado no chão, um fio (47μm de diâmetro) é cortado em cerca de 15cm longos pedaços. O isolamento de um cobre é removido por queima-lo com álcool. Um ciclo é formado com uma extremidade do fio e deslizou ao longo do tarso do animal O laço é amarrado na extremidade distal da tíbia para proporcionar um bom contato entre o animal eo fio. O fio é então fixado no tórax do animal com uma gota de cola de dois componentes (ProTempII, veja acima), e ligado ao amplificador diferencial através de uma pinça jacaré. Para melhorar a condutividade do fio em suas extremidades, uma gota de creme é aplicado eletrodo (Marquette Hellige, Freiburg, Alemanha) nas áreas de contato. A intensidade do sinal é então testada no monitor. Devido às propriedades filtro passa-baixa do lock-in-amplificador (10ms de tempo constante) eo lift-off/touch-down gradual do tarso, o sinal não é um sinal exata quadrados. Um, portanto, tem que definir limites adequados perto do ponto de transição para determinar o momento exato de contato tarsal e verificar manualmente cada evento determinado pelo software de digitalização. Com base no contato tarsal, que definiu o momento em que o tarso de uma perna dado estava no chão como posição e momento em que estava no ar como a fase de balanço. O sinal de disparo para a câmera é gravada simultaneamente com o traçado EMG eo sinal de contato tarsal, e permite um quadro preciso por correlação de quadros de comportamento e traços gravados. 6. A gravação óptica de movimentos de pernas para Análise Digital A freqüência de aprofundamento da pau insetos em superfícies escorregadias pode chegar a 3-4Hz (Graham e Cruse, 1981). Antes de gravar sequências de caminhar, um espelho é colocado em um ângulo de 45 ° para trás o animal para ter um monitor adicional visual para touch-down. A câmera é acionada externamente e imagens são alimentados em um PC através de uma interface FireWire. Gravamos andando seqüências de cima com uma câmera de vídeo de alta velocidade (Marlin F-033C, a Allied Vision Technologies, Stadtroda, Alemanha) em 100fps para analisar os movimentos das pernas digitalmente, e correlacioná-los com a atividade EMG e entre em contato tarsal. Durante a gravação de sequências de caminhar, o animal é iluminado com LED azul matrizes (30-50V DC, 24cd luminância, Eletrônica Workshop, Instituto Zoológico da Universidade de Colônia), que são ajustadas em intensidade para iluminar os marcadores fluorescentes. Segundo a literatura (Schlegtendal, 1934), bichos-pau não possuem visão de cores e não observamos um efeito adverso da iluminação de luz UV sobre a resposta de viragem. Um filtro amarelo na frente da lente da câmera suprime o comprimento de onda curta da luz de ativação e dá um maior contraste para as gravações de vídeo. Os arquivos de vídeo podem ser analisados ​​usando o software de rastreamento de movimento (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak serviço, Berlim, Alemanha). 7. Gravação de seqüências Walking Como controle, primeiro de uma seqüência andar com um animal intacto é gravado. A velocidade do padrão listrado está definido e padrão ea gravação de vídeo são iniciados aproximadamente ao mesmo tempo. Se o animal não começar a locomoção espontânea, ele pode ser estimulado no abdômen com um pincel (Bassler e Wegener, 1983), ou por um sopro de ar para as antenas. Neste caso, os animais tocou no lado esquerdo do abdômen tendem a virar à esquerda e vice-versa. O padrão listrado é mantida em movimento até que o animal pára de andar ou até depois de 3 minutos de gravações contínuas. A fim de testar até que ponto a atividade muscular em uma perna é dependente de estímulos sensoriais das pernas vizinhos, o animal é induzido a autotomize suas pernas. O site de autotomia fecha naturalmente dentro de segundos. Um exemplo de um animal com frente autotomized e patas traseiras é mostrado na Figura 3. Por exemplo, para experimentos com animais com apenas uma perna do meio, que induzem autotomia das pernas pró e metathoracic apertando o fêmur proximal com um par de fórceps (Schmidt e Grund, 2003) ou cortar as pernas ao nível dos coxas após a gravação do animal intacto. Depois que um mínimo de 30min para o tempo de recuperação é dado ao animal. Então novo recorde seqüências andar como antes. Em preparações reduzida, muitas vezes precisamos induzir andar usando pinceladas de tinta. 8. Resultados representativos: Figura 1 configuração Experimental; A:. Fotografia de um inseto de vara amarrada acima da superfície escorregadia, marcado com pigmentos fluorescentes para rastreamento perna e com fio para EMG de gravação e de medição de contato tarsal. B: Esquema de ligação dupla de gravação de contato tarsal da perna durante a caminhada sobre a superfície escorregadia. Figura 2. Posições para a colocação de eletrodos EMG nos músculos transferidor e retrator no tórax da perna meio pau de insetos. ML: perna média; FL: frente perna . Figura 3 Vara de insetos com fios de EMG nos músculos pró e afastador da perna meio no lugar, pernas da frente e traseiros foram retirados para estudar o efeito da presença de pernas vizinhos na cinemática e atividade muscular das pernas no meio a preparação reduzida. Figura 4. Traço Exemplo de afastador atividade EMG com sinal de referência de contato tarsal em uma perna dentro do meio durante a manobra. No início do trace (caixa azul em primeiro lugar) o retrator é ativo durante a postura, enquanto a perna tem contato com o solo ("circuito fechado"), indicando que a perna faz frente passos, depois de um interruptor de curto (caixa azul segundo), a retrator é ativo durante o balanço, enquanto que a perna está no ar ("circuito aberto", caixa azul terceiros), mostrando a ocorrência de passos para trás dirigido. Figura 5. Captura de tela de uma gravação do transferidor (traço em cima) e retrator (traço médio) músculos e traços de contato gravados simultaneamente tarsal (traço inferior). Observe a atividade alternando nos traços EMG que corresponde à atividade dos dois músculos no ciclo de passo, que é a atividade transferidor imediatamente antes e duranteswing, quando o contato tarsal rastrear sinais de perda de contato com o solo e atividade retrator após e durante o touch-down do tarso, quando a perna está na postura. A inserção mostra o arquivo de vídeo correspondente correspondente a esta gravação que é usado para verificar o comportamento do animal.