Etudier la base neurophysiologique de comportement locomoteur Adaptive chez les insectes

1. La surface de marche La surface de marche noir est constitué de deux plaques de laiton recouvert définitivement assemblés côte à côte et électriquement isolées l'une de l'autre par un large bande de 2mm à 2 composants de la colle époxy (UHU plus, UHU GmbH, Allemagne) directement sous l'axe longitudinal du l'animal. Elles produisent une surface totale de 13.5×15.5cm (figure 1). La séparation des demi-plans pour les jambes gauche et droite permet la surveillance indépendante de contact du tarse pour une seule jambe de chaque côté. La plaque est lubrifié avec un mélange glycérine / eau à un ratio de 95 pièces de glycérine à 5 parties saturées solution de NaCl à transmettre glissance et la conductivité électrique, la viscosité est d'environ 430cStokes (Shankar et Kumar, 1994). Le mélange est appliqué directement sur la surface et est dispersée avec un morceau de tissus mous pour assurer une épaisseur totale de 0,1-0.2mm. 2. Configuration stimulation optique Marcher épisodes sont déclenchés à l'aide de deux projecteurs tels que décrits par Scharstein (1989) pour projeter un motif rayé sur deux rondes, des écrans en verre dépoli (diamètre 130mm, écrans Marata, LINOS Photonics, Göttingen, Allemagne) qui sont positionnés à une distance d'env. 70mm à partir des yeux, et à un angle de 45 ° à l'avant gauche et droite de la plaque (Fig.1). La longueur d'onde du motif rayé est maintenu constant à λ = 21 °. La fréquence de contraste des stimuli en mouvement peut être varié entre 0,35, 0,72, 1,07 et 1.49Hz. Comme la réaction des animaux dépend uniquement de la fréquence ω contraste / λ (ω = vitesse angulaire, λ = longueur d'onde motif) si le contraste modèle est assez élevé (Fermi et Reichhardt, 1963), nous ne varie pas au cours des expériences λ . La luminance des bandes lumineuses sur le côté de l'animal est d'environ 15cd/m2 et le contraste 0.8. L'œil composé de l'insecte bâton (Carausius morosus) dispose de 24 ommatidies dans l'axe dorso-ventral (Friza, 1928) et un peu plus dans l'axe rostro-caudal. Comme l'angle de divergence de l'œil phasme est en moyenne de 6,2 ° (Jander et Volk-Henrichs, 1970) de notre longueur d'onde modèle était environ 4 fois l'angle de la ommatidies. Les expériences sont mis en place dans une cage de Faraday et de sombres effectuées dans une pièce sombre à 20-22 ° C. Avant la marche est induite par un modèle progressif sur les deux écrans où les rayures sur l'écran chaque déménagement vers l'extérieur, ou un seul faisceau noir sur fond blanc placé entre les écrans Le tournage est induite par le déplacement des bandes dans le même sens sur les deux écrans. Nous n'avons pas trouvé une corrélation entre la vitesse de déplacement et les rayures de l'angle du virage. Une fois la luminance de l'rayures sont mis à induire la marche, il ne nécessite généralement pas de réglage supplémentaire, mais il peut être ajusté pour différents animaux selon les besoins par la tension des lampes halogènes dans les projecteurs. 3. Préparer l'animal expérimental Femme phasmes adulte (Carausius morosus) sont collés (ciment dentaire, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Allemagne) face ventrale vers le bas sur un bâton mince balsa (3x5x100mm, LxHxP), qui est inséré dans un tube de laiton qui a de multiples connecteurs. L'animal est maintenu enfoncé pendant environ une minute jusqu'à ce que la colle est au moins partiellement, durci. La tête et les jambes dépassent de l'avant et à côté de la cheville pour permettre leur libre circulation. La zone de la coxae de toutes les jambes ainsi que la majeure partie de l'abdomen doit être laissé libre de colle. La tête d'insecte, le thorax et les extrémités distales de chaque fémur et le tibia sont marqués avec des pigments fluorescents (Dr Kremer Farbmühle, Aichstetten, Allemagne) mélangé avec du ciment dentaire pour le suivi de la vidéo plus tard. 4. Placement des électrodes EMG L'activité musculaire des muscles de la jambe différents, tels que, dans cet exemple, le rapporteur et les muscles coxae écarteur, qui sont situés dans le thorax et la prolongation cause (mouvement vers l'avant) et la rétraction (mouvement vers l'arrière) de la jambe, est enregistrée au moyen d'électrodes EMG implanté dans le thorax. Tous les enregistrements EMG sont différentiellement amplifiés. Le signal a été amplifié dans un préamplificateur 100x (électronique atelier, Institut de Zoologie, Cologne), passe-bande filtrée, (100Hz-2000Hz), encore amplifié (10x), et importées via un convertisseur AD en Spike2 (Vers.5.05, DEC, Cambridge, UK). Les électrodes sont faites de fils de cuivre revêtu (Elektrisola, Eckernhagen, Allemagne; 47μm de diamètre extérieur). Pour une électrode, deux fils sont d'abord enduit avec de la colle, puis, les deux fils sont tordus collante autour de l'autre À une extrémité les extrémités des fils torsadés sont soudées à une mini-fiche. À l'autre bout les fils sont coupés pour fournir termine propre sans isolation pour l'insertion dans l'animal. Les électrodes EMG sont PluggeD dans le petit connecteur à l'extrémité du tube de laiton. Une broche Minuten est utilisé pour percer des trous dans la cuticule petites Les extrémités coupées de l'électrode sont ensuite séparés et inséré dans un muscle à environ 1mm de distance les uns des autres, qui, dans notre expérience, donne un bon signal à bruit. Il faut prendre soin de ne pas insérer les électrodes trop profondément dans le muscle afin d'éviter sa détérioration. La figure 2 montre l'emplacement des électrodes dans le thorax de l'animal. La figure 3 montre un animal avec les fils électrodes en place. Nous utilisons une petite goutte de colle histoacrylic (3M Vetbond, St.Paul, MN, USA) pour maintenir les fils en place. Un fil de terre est inséré dans l'abdomen. 5. Enregistrement de la contacter tarsien Contactez-tarsien est toujours enregistré avec des traces EMG. Depuis la surface glissante est divisé en deux moitiés, un maximum de deux controlatéral contacts tarse peut être enregistré dans le même temps. À cette fin, la jambe est utilisé comme un "interrupteur" pour fermer un circuit entre la plaque et l'amplificateur. Le courant peut être appliquée aux plaques séparément par deux prises à la base de chaque plaque. Nous pouvons générer deux signaux carrés avec 2-4mV amplitudes avec un générateur d'impulsions (Modèle MS501, électronique atelier, Institut de Zoologie, Cologne) qui sont la phase retardée de 90 °. Les signaux sont atténués de 60dB (/ 1000) et appliquée aux deux moitiés de la surface glissante. Dans cette expérience, nous n'utilisons que l'un des deux signaux. Il est simultanément introduit dans un lock-in-amplificateur comme un signal de référence. Le lock-in-amplificateur 2-phase (Atelier d'électronique, Institut de Zoologie, Cologne) amplifie sélectivement les signaux que de la même fréquence et de phase que le signal de référence fourni. Un second canal ne détecte que le signal de 90 ° phase retardée. Signaux de bruit à des fréquences autres que la fréquence de référence sont rejetés et ne pas affecter la mesure. Le signal de sortie de l'amplificateur est alimenté dans un convertisseur AD (Micro 1401k II, DEC, Cambridge, UK) et numérisé à l'aide Spike2. Entre touch-down et le décollage du tarse sur et à partir de la surface glissante, le courant de la plaque par le biais du tarse et le tibia dans le fil de cuivre (voir ci-dessous: 5.3 à 5.8). L'amplificateur choisi a une résistance d'entrée élevée (1MOhm) et la tension du signal est très faible afin d'éviter d'affecter le comportement de marche de l'animal. Le courant traversant le tarse et le tibia est entre 2 et 4NA. Le délai du signal pendant touch-down, entre l'entrée dans le lubrifiant et la surface de contact est inférieure à 1 ms. La transition du signal de contact pendant le décollage est moins raide et plus retardée. Cela est dû à la déchirure retardée du lubrifiant à partir du tarse par un effet de capillarité et en raison du mouvement de la jambe, sans terminer le décollage de la phase d'oscillation. Le tube de laiton avec le bâton de balsa pour lequel l'animal est collé est inséré dans un micromanipulateur pour permettre le réglage de hauteur de l'animal entre 7 et 12mm au-dessus de la surface glissante, ce qui correspond à la hauteur lors de la marche libre. Afin de mesurer le flux de courant à chaque fois le tarse des insectes de la jambe surveillée est sur le terrain, un fils (47μm de diamètre) est découpé en morceaux d'environ 15cm de long. L'isolation d'un cuivre est éliminé par l'brûlant avec de l'alcool. Une boucle est formée avec une extrémité du fil et a glissé sur le tarse de l'animal La boucle est liée à l'extrémité distale du tibia pour fournir un bon contact entre l'animal et du fil. Le fil est ensuite fixé sur le thorax de l'animal avec une goutte de colle à deux composants (ProTempII, voir ci-dessus), et relié à l'amplificateur différentiel par une pince crocodile. Pour améliorer la conductivité du fil à ses extrémités, une goutte de crème électrode est appliquée (Marquette Hellige, Freiburg, Allemagne) sur les zones de contact. La force du signal est ensuite testé sur le moniteur. Grâce aux propriétés filtre passe-bas de la serrure-dans-amplificateur (10ms de temps constant) et le lift-off/touch-down progressive du tarse, le signal n'est pas un signal exacte carrés. On dispose donc de définir des seuils adaptés à proximité du point de transition afin de déterminer le moment exact de contact du tarse et vérifier manuellement chaque événement déterminé par le logiciel de numérisation. Basé sur le contact du tarse, nous avons défini le moment où le tarse d'une jambe a été donnée sur le terrain que la position et le moment où il était dans l'air comme la phase d'oscillation. Le signal de déclenchement de l'appareil photo est enregistrée simultanément avec la trace du signal EMG et de contact du tarse, et permet à un cadre précis par corrélation cadre du comportement et des traces enregistrées. 6. Enregistrement optique des mouvements de la jambe pour l'analyse numérique La fréquence approfondissement de phasmes sur les surfaces glissantes peuvent atteindre 3-4Hz (Graham et Cruse, 1981). Avant d'enregistrer des séquences de marche, un miroir est placé à un angle de 45 ° derrière l'animal d'avoir un moniteur visuel supplémentaire pour les touch-down. La caméra est déclenchée à l'extérieur et les images sont introduits dans un PC via une interface FireWire. Nous enregistrons la marche des séquences d'en haut avec une caméra vidéo à haute vitesse (F-033C Marlin, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Allemagne) à 100fps pour analyser les mouvements des jambes numériquement, et les corréler avec l'activité EMG et le contact du tarse. Pendant l'enregistrement de séquences de marche, l'animal est illuminé de bleu matrices de diodes (30-50V DC, 24cd luminance, Atelier d'électronique, Institut de Zoologie, Université de Cologne), qui sont ajustés en intensité pour éclairer les marqueurs fluorescents. Selon la littérature (Schlegtendal, 1934), les phasmes ne possèdent pas la vision des couleurs et nous n'avons pas observé un effet négatif de l'illumination UV sur la réponse de tourner. Un filtre jaune en face de la lentille de la caméra supprime la courte longueur d'onde de la lumière d'activation et donne un contraste plus élevé pour les enregistrements vidéo. Les fichiers vidéo peuvent être analysés en utilisant un logiciel de suivi de mouvement (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak service, Berlin, Allemagne). 7. Enregistrement de séquences de marche Comme un contrôle, d'abord une séquence de marche avec un animal intact est enregistrée. La vitesse du motif rayé est réglé, et le modèle et l'enregistrement vidéo sont lancés à peu près au même moment. Si l'animal ne commence pas la locomotion spontanée, elle peut être stimulée à l'abdomen avec une brosse (Bassler et Wegener, 1983), ou par une bouffée d'air pour les antennes. Dans ce cas, les animaux touchés sur le côté gauche de l'abdomen ont tendance à tourner à gauche et vice versa. Le motif rayé est maintenu en mouvement jusqu'à ce que l'animal s'arrête de marcher ou jusqu'à ce que après 3 minutes d'enregistrements continus. Afin de tester dans quelle mesure l'activité musculaire à la jambe dépend entrée sensorielle à partir jambes voisins, l'animal est amené à autotomize ses jambes. Le site d'autotomie se referme naturellement en quelques secondes. Un exemple d'un animal à l'avant et les pattes arrière autotomized est montré dans la figure 3. Par exemple, pour des expériences avec des animaux ayant une seule jambe du milieu, on induit autotomie des pattes pro et métathoraciques en pinçant le fémur proximal avec une paire de pinces (Schmidt et Grund, 2003) ou de couper les jambes au niveau de l'os coxal après l'enregistrement de l'animal intact. Après cela, un minimum de 30min pour le temps de récupération est donné à l'animal. Ensuite nous enregistrons de nouvelles séquences de marche comme avant. Dans les préparations réduite, nous avons souvent besoin de provoquer la marche à l'aide coups de pinceau de peinture. 8. Les résultats représentatifs: Figure 1 Montage expérimental; A:. Photo d'un phasme attachés dessus de la surface glissante, a marqué avec des pigments fluorescents pour le suivi de la jambe et câblées pour enregistrement EMG et la mesure sans contact du tarse. B: schéma de câblage pour l'enregistrement de la jambe double contact du tarse pendant la marche sur la surface glissante. Figure 2. Positions pour le placement des électrodes EMG dans les muscles rapporteur et enrouleur dans le thorax de la jambe moyenne bâton insecte. ML: patte médiane; FL: jambe avant Figure 3. Bâton insectes avec des fils de l'EMG dans les muscles pro-et rétracteurs de la jambe moyenne en place; pattes avant et arrière ont été enlevés pour étudier l'effet de la présence de jambes voisins sur la cinématique et l'activité musculaire des jambes du milieu dans la préparation réduite. Figure 4. Exemple de traces d'enrouleur activité EMG avec signal de référence de contact du tarse dans une jambe à l'intérieur du Moyen-pendant le tournage. Au début de la trace (la première boîte bleue) de l'écarteur est actif pendant la position, tandis que la jambe est en contact au sol ("circuit fermé"), indiquant que la jambe fait avancer les étapes; après un passage de courte durée (seconde boîte bleue), le écarteur est actif pendant le swing, tandis que la jambe est dans l'air ("circuit ouvert", troisième boîte bleue), montrant l'apparition de pas en arrière dirigé. Figure 5. Capture d'écran d'un enregistrement de l'rapporteur (trace supérieure) et écarteur (milieu de trace) les muscles et la trace de contact enregistrées simultanément tarse (oligo-bas). Notez l'activité en alternance dans les traces EMG qui correspond à l'activité des deux muscles dans le cycle étape, qui est l'activité rapporteur juste avant et pendantbalançoire, lorsque la trace du tarse contact signale la perte de contact avec le sol, et l'activité écarteur pendant et après touch-down du tarse, quand la jambe est en position. L'insert montre le fichier vidéo correspondant correspondant à cet enregistrement qui est utilisé pour vérifier le comportement de l'animal.