בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

1. חלבון הביטוי Clone חלבון קרום עניין לתוך וקטור מתאים הביטוי laevis הביצית Xenopus כגון pTLN 11 או 12 pSG01MX. וקטורים מותאם להכיל 5 'ו 3' Xenopus laevis β-גלובין מתורגמים האזורים 11,12, אתר הגבלה ייחודי, אתר מקדם RNA נמצא לפני UTR 5 '11. רכיבים אלה נדרשים עבור ביטוי אופטימלי ביציות, לינאריזציה של הפלסמיד לפני סינתזה סינתזה mRNA mRNA, בהתאמה. 2. ציסטאין המוטציה העלילה קייט-דוליטל מועסק כדי לזהות את התחומים הטרנסממברני של החלבון ממוקד באמצעות רצף החומצות האמיניות של החלבון (ProtScale, ExPASy) 13. הנתונים מוצגים כפי hydrophobicity לעומת מספר רצף. שאריות המציגים ערכים חיוביים נמצאים קרוב לוודאי בתחום הטרנסממברני. השתמש העלילה כדי לקבוע את שאריות הסביר ביותר ממוקם בממשק שבין הטרנסממברני ותחומים תאיים כי יהיה מוטציה כדי ציסטאין. כמו קביעת ממשק של תחום הטרנסממברני ובאזור תאיים לא ניתן לחזות בוודאות גמורה באמצעות העלילה קייט-דוליטל, חשוב לבחון מגוון של שאריות אשר חזו להיות על הממשק. זה האזור של חלבון נבחרה התנועה החזוי של השינוי fluorophore.During קונפורמציה, fluorophore ינוע בין סביבת הידרופילי ו הידרופובי או בין מרווה מים יותר ופחות מרווה סביבה ומים. כל השינויים האלה ניבא בסביבה יגרום לשינוי עוצמת הקרינה. QuickChange לאתר בימוי mutagenesis Kit (Stratagene) משמש כדי לייצר יחידה בונה ציסטאין נגיש extracellularly. בקיצור, לערבב 5 μL של חיץ התגובה 10X, 2 μL של ה-DNA ng / μL 5 פלסמיד, 1.25 μL כל אחד 100 ng / μL קדימה לאחור תחל, 1 μL של dNTP (100 מ"מ), ו – 39.5 μL של מזוקקים פעמיים המים. לבסוף, להוסיף 1 μL של פולימראז הדנ"א PfuTurbo (Stratagene). Primers המשמש בשלב זה צריך להיות מתוכנן עם המוטציה ציסטאין על שאריות תאית של עניין. תוכנית Cycler תרמית את המפרטים הבאים: מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 12-18 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 ° C עבור 1 דקה, 68 ° C למשך דקה 1 לכל אורך kb פלסמיד. הטמפרטורה חישול (55 ° C) מחושב ישירות טמפרטורת ההיתוך של כל פריימר. השלב הסופי ניתן לתכנת להחזיק את הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס אם התגובה מתבצעת בין לילה. מספר מחזורי תלוי המוטציה. השתמש ב 12 מחזורים עבור מוטציות נקודתיות, 16 מחזורים לשינוי חומצה אמינית אחת, או 18 מחזורי מרובות הוספות חומצת אמינו. הוסף 1 μL של DpnI (ניו אינגלנד Biolabs) לתערובת התגובה, לערבב ידי pipetting ו צנטריפוגה (6000 סל"ד) למשך דקה 1. דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בראש להפשיר 10 אלקטרו המוסמכת תאים (Invitrogen) על קרח דגירה סטרילי SOC מדיה (20 מ"ג / מ"ל tryptone, 5 מ"ג / מ"ל תמצית שמרים, 1 מ"ג / מ"ל NaCl, 0.4 מ"ג / מ"ל KCl, 0.02 מ 'Mg 2 +, 0.02 גלוקוז M, ddH2O) בשעה 37 ° C עד הצורך. 20 Aliquot μL של תאים לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל ולהוסיף 1 μL של ה-DNA מעוכל על התאים. למלא את התא-Porator (החיים טכנולוגיות) עם מי קרח, כדי לקבוע את קיבול 330 μF, שיעור תשלום מהיר, עמידות על Voltage-Booster עד 4 kΩ. פיפטה 20 μL של פתרון תא / דנ"א לתוך תאים porator cuvettes. מניחים את cuvettes לתוך Porator-Cell, לסגור את המכסה, לחבר את כבל החשמל, ולהפוך את החוגה קובט הנכון. הגדר את אספקת החשמל לגבות והחזק "למעלה" עד מתח קורא 430. סובבו את החוגה כדי להפעיל לחץ על הזרוע. אם יש קולות נפץ, לנסות שוב את electroporation. פיפטה את התאים קובט ולהעבירם 1.5 מ"ל של SOC התקשורת. דגירה של 1.5 שעות ב 37 ° C עם רעד. העברת 30 μL של פתרון SOC / התא LB / צלחות אמפיצילין אגר (10 מ"ג / מ"ל tryptone, 5 מ"ג / מ"ל תמצית שמרים, 10 מ"ג / מ"ל NaCl, 15 מ"ג / מ"ל אגר, DDH 2 O ו – 100 ng / μL אמפיצילין ). מורחים את התאים על הצלחת דגירה את הצלחת ב 37 ° C במשך הלילה. קציר מושבות אחת מן הצלחות ו 5 לחסן תרבויות מ"ל המכיל LB / אמפיצילין (10 מ"ג / מ"ל tryptone, 5 מ"ג / מ"ל תמצית שמרים, 10 מ"ג / מ"ל NaCl, 100 ng / μL אמפיצילין DDH 2 O) בתקשורת. תלחצו על 37 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות. בצע miniprep דנ"א באמצעות ערכת Nucleospin פלסמיד (Macherey-נגל). איכותית לבחון את המוצר על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. Quantitiate את התשואה של ה-DNA באמצעות 2000c Nanodrop ספקטרופוטומטר (Thermo Scientific). ודא הכניסה של מוטציה על ידי רצפי DNA. <p class="Jove_title"> 3. mRNA סינתזה כדי linearize את ה-DNA, 3 לעכל מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד בנפח 50 ליטר עם חוצץ התגובה המתאימה μL 5 ו 1 μL של אנזים הגבלה במשך שעה 1 ב 37.0 ° C. בעזרת High-Pure טיהור PCR מוצר Kit (Roche Applied Science), להוסיף 350 חיץ מחייב μL אל הבקבוקון לעכל בקצרה מערבולת. הערכה זו משמשת מכיוון שהיא מכילה guanidiniumisothiocyanate מה שהופך את המוצר כיתה RNA. המקום עמודות ספין צינורות איסוף לטעון את הטור עם פתרון ה-DNA לעכל. צנטריפוגה ב g 18,000 למשך 20 שניות וזורקים זרימה דרך. הוספת 500 μL של חיץ לכבס לעמודה. צנטריפוגה 20 שניות גרם 18,000 וזורקים לזרום. הוספת 200 μL של חיץ לכבס לעמודה. צנטריפוגה 30 שניות או עד עמודה יבש על 18,000 g. מניחים את הטור ספין צינור צנטריפוגות autoclaved 1.5 מ"ל ולהוסיף 50 μL מים DEPC שטופלו לעמודה. Elute ידי centrifuging למשך 30 שניות על 18,000 g. לרכז את ה-DNA eluted כדי μL כ -15 שתוצאתה 0.5 מיקרוגרם ב μL 3 של פתרון. בחר את הנכון mMessage mMachine Kit (Ambion) על פי רצף מקדם אתר ב-DNA פלסמיד (SP6, T7). הוסף 5 μL 1-NTP כובע לערבב, 3 DNA לינארית μL מהשלב הקודם, 1 חיץ שעתוק μL, ו 1 μL של RNA פולימראז המתאימה. דגירה של 1.5-2 שעות ב 37 ° C. הוסף 12.5 μL של LiCl מתיק, 15 מים DEPC μL, בקצרה לערבב (לא מערבולת), צנטריפוגות ב g 11,000 במשך 10 שניות, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות עבור משקעים. טרום מגניב צנטריפוגות עד 4 ° C ו צנטריפוגות לפחות 15 דקות בשיא המהירות אחרי משקעים. לאחר צנטריפוגה גושים חומים צריך להיות גלוי בתחתית הצינור. בזהירות להסיר לחלוטין את supernatant ולהוסיף 150 μL של אתנול RNA 70% כיתה מקורר -20 ° C. צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות במהירות מלאה. הסר את supernatant לחלוטין, יבש בקצרה (1-2 דקות) ב Vacufuge Eppendorf Plus, לפזר את כדורית לבנה כעת μL 12 מים DEPC. Quantitiate את התשואה של ה-mRNA באמצעות 2000c Nanodrop ספקטרופוטומטר (Thermo Scientific). 4. הביצית להסרת פרוטוקול זה אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של WPI ועדת שימוש. לפני המבצע, הצפרדע צריך להיות צמו במשך 12 שעות כדי למנוע הקאות במהלך הניתוח. בצע פתרון של 0.5-3.0 גרם MS-222 מומס במים. הוסף סודיום ביקרבונט עד לפתרון יש pH 7.0-8.0. MS-222 משמש כחומר הרדמה עבור הצפרדע במהלך הניתוח. חשוב ללבוש כפפות nitrile בכל עת בזמן הטיפול MS-222 ולהכין את הפתרון מתחת למכסה המנוע כימי לטבול את הצפרדע בפתרון MS-222 עד הצפרדע איבד ליישר ולצבוט רפלקסים הבוהן. כדי לבדוק חוסר תגובה, לצבוט את הבוהן של הצפרדע. הנח את הצפרדע בצד הגבי בצד הסופג של כרית חיתול רטוב. זה ימנע נזק לעור הצפרדע. שמור על נייר מגבת רטובה ליד הצפרדע בכל עת, כמו צפרדע חייב להישמר לחה לאורך הניתוח. אם בעיני צפרדע פתוחים, חשוב להרטיב אותם עם תמיסת מלח. אם הצפרדע מראה סימנים של התעוררות, ויוצקים את ההרדמה על הצפרדע ולהמתין עד צפרדע הופך להגיב. בצע קמצוץ הבוהן שנייה לפני המשך ההליך. ביצוע חתך קטן coelomic או שמאלה או ימינה של קו האמצע של הצפרדע. חתכים צריכה להיעשות על הצדדים לסירוגין עם ניתוחים שלאחר מכן. תביאו את השחלה אל הצד החיצוני של הצפרדע ולהסיר את השחלה. הימנע מנגיעה השחלות לעור של צפרדע. אם הדימום מתרחש, להפעיל לחץ עם טיפ Q-סטרילי עד שהדימום ייפסק. תפר את החתך באמצעות דפוס תפר קטע עם חומר 3.0-4.0 Vicryl תפר Ethicon (Johnson & Johnson). כאשר תפירת, להשתמש מכשירי ניתוח לקשור קשר אחד בכל פעם, אל תיגע בעור של הצפרדע. חשוב גם אל תפר coelomic שכבות עור בנפרד. זה עולה בקנה אחד עם הנחיות NIH עבור ביצה קצירת הביצית בתוך Xenopus laevis (ראה: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). לאחר הניתוח, הצפרדע לא חייבים לעבור ניתוח לפחות 2 חודשים. ראוי גם לקבוע אם הצפרדע הוא בריא מספיק כדי לעבור ניתוחים שלאחר מכן. מקסימום של 6 ניתוחים שניתן לבצע על כל צפרדע עם מסוף ניתוח 6 ה להיות. 5. הביצית Defoculation ו הזרקת mRNA האונה השחלות מבודד מחולק במספריים לחלקים קטנים יותר. גושים מועברים לתוך בתמיסת רינגר + Ca 2 + עם collagenase (8.6g / L NaCl, 0.3 גר '/ L KCl, ו 0.33 g / L CaCl 2). נער בעדינות את הפתרון לעיכול עבור 2 שעות ב 18 ° C. אם רוב ביציות מופרדות, לשטוף עם ביציות בתמיסת רינגר – Ca 2 + (8.6 g / L NaCl ו – 0.3 g / L KCl). דגירה ביציות במשך עשר דקות בתמיסת רינגר – Ca 2 +. העברת ביציות כדי בתמיסת רינגר + Ca 2 +. הזרק ביציות עם 25 ng של mRNA, נפח סופי של 50 NL עם השנייה Nanoject אוטומטי Nanoliter Injector (דראמונד), עם 3.5 "צינורות דראמונד נימי. הערה: כמות ה-mRNA משתנה בהתאם חלבון המטרה. לאחר, ביציות הזרקת דגירה 3-7 ימים בתמיסת רינגר (90 mM NaCl, KCl mM 2, 5 מגבים מ"מ, 2 מ"מ CaCl 2, pH 7.4) ו 1 מ"ג / מ"ל gentamycin ב 18 ° C ב 8 כהה. 6. אתר ספציפי סימון פלואורסצנטי לפני המדידה, דגירה ביציות דקות 45 במאגר העמסה (110 mM NaCl, 2.5 סודיום ציטרט mM ו -10 מגבים mm / טריס ב-pH 7.4) ו – 45 דקות במאגר שלאחר טעינה (100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 5 מ"מ BaCl 2, 5 מ"מ NiCl 2, 10 מגבים mm / טריס ב-pH 7.4) כדי להגדיל את תאיים Na + ריכוז 14. עבור מדידות הקרינה, דגירה ביציות במאגר שלאחר טעינה המכיל 5 מיקרומטר של fluorophore הרצוי [לשעבר. tetramethylrhodamine-6-maleimide (TMRM) או והעמסת-5-maleimide (FM)] למשך 5-10 דקות. לאחר תיוג fluorophore, לשטוף את ביציות ממצה עם חיץ שלאחר טעינה צבען חינם 3. 7. Electrophysiology הפוך את microelectrodes ידי משיכת בורוסיליקט נימים (1B150F-4, Precision Instruments העולם) באמצעות חולץ micropipette (דגם PC-10, Narishige). מלאו את האלקטרודות עם 3 מ KCl ולבדוק את ההתנגדות. ההתנגדות צריכה להיות בין 0.5-1.5 MΩ 15. לצייד את מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Carl Zeiss, Axio מיקרוסקופ פלואורסצנטי בוחן) עם מסנן 535DF50 עירור, 565 EFLP פליטת לסנן, מראה dichroic 570DRLP (אומגה אופטי) עבור ניסויים ציסטאין סריקה. מניחים את הביצית בתא RC-10 (וורנר מכשירים) על הבמה מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעדינות להכניס את האלקטרודות מפוברק לתוך הביצית. באמצעות מגבר Turbo Tec-05X (NPI אלקטרוניקה), להחזיק את פוטנציאל הממברנה בשווי קבוע ולמדוד את שטף יונים על פני קרום פתרון חילופי הדברים הבאים או על ידי שינוי פוטנציאל הממברנה. עבור מדידות הקרינה במקביל, להשתמש 100 W מקור אור טונגסטן כדי להלהיב את fluorophore התורם photodiode PIN-022A (United Technologies גלאי) כדי לזהות שינויים בעוצמת הקרינה. הן מגבר ו photodiode הם interfaced, באמצעות מערכת 1440A נתונים הרכישה Digidata (אקסון מכשירים), עם מחשב ניצול pCLAMP10 תוכנה (מכשירים אקסון) לרכישת נתונים ההקלטה. עבור סריקה ציסטאין, למדוד את השינוי בעוצמת הקרינה בבית הנוכחי צעדים נייח מתח באמצעות הנשלטות על ידי תוכנה 10 pCLAMP (התקנים מולקולריים). בהתאם חלבון הממברנה של עניין, הפתרון תאיים נועד להבטיח הנוכחית נייח. מתאם בין שינויים בעוצמת הקרינה על מדידות תפקודי של חלבון המטרה. 8. אחידות מדידות וקביעת מגבלות מרחק. מדידות אחידות צריך לקחת לצד מדידות מרחק 8 כדי לחשב את טווח κ 2 ערכים. אחידות מודד את הניידות היחסית של fluorophore בהתאם לסיבובו 16. שימוש במסננים מקוטב (Linos Photonics Inc), למדוד את האור מקבילות בניצב הנפלטת FM או עירור TMRM הבאה עם אור מקוטב על שאריות חומצת אמינו של עניין. המדידות נלקחות תחת חילופי התנאים פתרון 8 פוטנציאל הממברנה קבוע כדי לקבוע את הניידות של fluorophores. אחידות ניתנת על ידי r = (אני | |-I ⊥) / (אני | | + 2i ⊥) שבו אני | | הוא האור הנפלט מקביל ואני ⊥ הוא האור הנפלט בניצב 16. כדי לחשב את השגיאה במדידות מרחק, κ 2 מקסימום = 2 / 3 (1 + F rd + F ra + 3F rd * F ra) ו κ 2 דק '= 2 / 3 (1 – (F rd ra + F) / 2 ) איפה F rd = (r d / r o) 0.5 ו-F ra = (r / r o) 0.5; r הוא אנאיזוטרופיה של TMRM, r d הוא אנאיזוטרופיה של FM, r o אנאיזוטרופיה היא היסוד של כל fluorophore 8 . כדי למדוד מגבלות מרחק, השתמש holoenzyme שבו יש שני ציסטאין נגיש resid תאייםUES. ככל ביציות יתקיים פוטנציאל הממברנה קבוע מרחק קבוע ולכן במהלך המדידות, שם לא צריך להיות שינוי הקרינה כפונקציה של המדינה קונפורמציה של החלבון. דגירה ביציות במאגר שלאחר טעינה המכיל 1 מיקרומטר FM (acceptor fluorophore) ו 4 TMRM מיקרומטר (fluorophore התורם) במשך 30 דקות על הקרח בחושך, או רק 1 מיקרומטר FM. זה מאפשר מדידות להתבצע עבור holoenzymes שכותרתו עם ובלי acceptor fluorophore 8. צייד את המיקרוסקופ עם 475DF40 עירור לסנן, 530DF30 פליטת לסנן המראה 505DRLP dichroic. למדוד את התלות בזמן של התורם הלבנת בנוכחות והיעדר fluorophore acceptor. במהלך הזמן של מדידות אלה, זרימת הפתרון צריך להיות רציף. אחרת, חום הנגרמת להגדיל הקרינה לאורך זמן אפשר לראות. השוני photodestruction עם ובלי fluorophore acceptor משמש כדי לחשב את המרחק בין שתי שאריות. Holoenzymes המכיל רק את fluorophore התורם יחוו שיעור photodestruction מהר יותר מאשר עם holoenzymes fluorophore acceptor. Holoyenzymes המכיל גם התורם fluorophore acceptor יציגו שיעורי photodestruction איטי כאשר בסמיכות אחד לשני 8. באמצעות תכונה Clampex ב pClamp10, ממוצע התוצאות של photodestruction של fluorophore תורם מינימום של ארבעה הקלטות הביצית. לאחר התוצאות היו בממוצע, להשתמש בפונקציה מעריכית (monoexponential, biexponential) כדי לקבל עקומת בכושר הטוב ביותר. עיקול בכושר הטוב ביותר שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את קבוע הזמן photodestruction של fluorophore התורם עם ובלי acceptor. לקבוע את היעילות של העברת אנרגיה שניתן על ידי המשוואה E = 1-Γ התובע / Γ D 17, שם GDA מתייחס זמן קבוע עבור זוג תורם / acceptor fluorophore ו Γ D מתייחס זמן קבוע fluorophore רק תורם. שימוש פורסטר equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), המרחק בין שיירי ציסטאין שכותרתו ניתן לקבוע; E הוא סריג יעילות, R הוא המרחק בין התורם fluorophore acceptor, ו-R o הוא המרחק יעילות של 50% עבור התורם acceptor זיווג 17. R o נשלטת על ידי המשוואה R o = (9.7×10 3 JΦ D n -4 κ 2) שבו J הוא חפיפה ספקטרלית מנורמל של התורם פליטה וקליטה acceptor, Φ D הוא התשואה הקוונטי של פליטה תורם ללא fluorophore acceptor, n הוא אינדקס השבירה, ו κ 2 הוא הגורם אוריינטציה עבור אינטראקציות דיפול דיפול-8. 9. תנועה יחסית של יחידות משנה חלבון השתמש בונה ציסטאין כפול אשר מסומנים עם acceptor ו fluorophores התורם. בניסויים אלה, שינוי המרחק בין שתי שאריות ציסטאין תימדד. מאז זה המקרה, את עוצמת הקרינה הבאה תיוג על כל שאריות צריכה להיות עצמאית של המדינה קונפורמציה של החלבון 8. לפיכך, כל שינוי להעביר תהודה הקרינה אנרגיה תהיה תוצאה של שינוי המרחק בין התורם fluorophores acceptor. צייד את המיקרוסקופ עם 475AF40 עירור לסנן, 595AF60 פליטת לסנן המראה 505DRLP dichroic. בניסויים אלה, התורם הוא נרגש את הקרינה של fluorophore acceptor נמדד. השתמש בשיטה המתאימה (, מתח ליגנד, פתרון חילופי) כדי להפעיל את חלבון קרום ובמקביל למדוד את השינוי בעוצמת הקרינה. עלייה בעוצמת הקרינה יציין כי שני fluorophores ובכך two שאריות עוברים ביחד קרוב. ירידה בעוצמת הקרינה יציין כי שני fluorophores ובכך two שאריות נעות זו מזו. לבסוף, לא חל שינוי בעוצמת הקרינה יציין כי שני fluorophores ובכך two שאריות הם באותו מרחק על שינוי קונפורמציה של החלבון. 10. נציג תוצאות תיוג שאריות ציסטאין תאיים עם fluorophores ספציפית מאפשרת את חקירת התנועה של חלבונים בממברנה על שינויי קונפורמציה. מתח אופייני מהדק עקבות fluorometry מוצג באיור 1. השינוי בעוצמת הקרינה (זכר נמוך), המהווה את תנועת fluorophore מ הידרופילי יותר לסביבה הידרופובי יותר או מרווה מים יותר לסביבה פחות מים מרווה, התוצאות משינוי קונפורמציה בחלבון על פתרון חילופי (העליון עקבות). טכניקה זו יכולה להיות extended לקבוע מגבלות מרחק בין שתי שאריות. תוצאות ניסויים אלה שמוצג באיור 2. בנוכחות flurophore acceptor (אדום), photobleaching מתרחשת בקצב איטי יותר מאשר ללא fluorophore acceptor (שחור). שיעור photobleaching קשורה ישירות המרחק בין שני fluorophores לפי המשוואה פורסטר 17. תוצאות כאלה יכולים להיות מתואמים מדינות קונפורמציה שונה של חלבון כמו מאומת על ידי שני מתח האלקטרודה מהדק ביצע ניסויים במקביל. באיור 1. ההקלטה נציג תחבורה יונים שינויים בעוצמת הקרינה. למעלה, מהדק מדידות זרם בנוכחות פתרון מבחן + Na ו – K + פתרון מבחן בנוכחות של 10 מיקרומטר ו 10 ouabain מ"מ. התחתונה, שינויים בעוצמת בתפרחת נמדד בד בבד עם המדידות מהדק הנוכחית 3,8,19. איור 2. תלות זמן של photobleaching. Photodestruction התורם נמדדת בהעדר (שחור) ונוכחות של acceptor fluorophore (אדום). כל זכר הוא ממוצע של 4 הקלטות הביצית.