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Neurociência

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

Published: June 03, 2011
doi:
10.3791/2600
, , ,
1Department of Anatomy and Neurobiology,University of Tennessee Health Science Center

Summary

これは、錐体ニューロンから電気記録を作成する目的のための器官培養における新皮質スライス標本を準備し、維持するためのプロトコルです。

Abstract

我々は、ラットの大脳新皮質から錐体ニューロンにおける電位依存性カリウムチャネルの発現と機能的役割を研究している。なぜなら、これらのチャネルの特定の薬理学的作用物質の不足のため、我々は、チャネルの発現を操作するために遺伝学的アプローチを採用している。我々は、細胞の形態と皮質の層のパターンを維持するために器官培養の準備（16）を使用してください。我々は通常、生後日数8-10で急性最近、大脳皮質を分離して3-7日培養でスライスを維持する。これは、私たちは、急性スライスを使用して我々の仕事と同じような年齢で神経細胞を研究することができますし、スライスにあふれんばかりの興奮性の接続の開発を最小限に抑えます。我々は電流または電圧クランプの全細胞パッチクランプと赤外線照明（IR -）と微分干渉顕微鏡（DIC）を使用して、レイヤーII / IIIまたはVで視覚的に特定された錐体ニューロンから記録。我々は、その機能を研究するためにチャネルの発現を操作するために、野生型または変異カリウムチャネルのDNAの遺伝子銃（遺伝子銃）トランスフェクションを使用してください。トランスフェクションされた細胞は容易に緑色蛍光タンパク質（GFP）のcDNAとのコトランスフェクション後の落射蛍光顕微鏡で識別されます。私たちは、同じスライスから同じ層に隣接した、トランスフェクトされていないニューロンにトランスフェクトされた細胞の記録を比較する。

Protocol

1。スライシングの日前の準備我々は、それは手術器具をオートクレーブし、前のスライスの日に溶液を調製する方が効率的です見つける。 オートクレーブの楽器。 （手術とスライスが半無菌条件下で行われる）。個々にオートクレーブ紙に包んで次のパッケージを、オートクレーブ。 手術のパッケージ：へら、＃22手術用メスの刃?…

Discussion

我々は、ラットの大脳新皮質（4、9-11）から錐体ニューロンにおける電位依存性カリウムチャネルの発現と機能的役割を研究している。なぜなら、これらのチャネルの特定の薬理学的作用物質の不足のため、我々はチャンネル式（1,14,15,17-19）を操作するための遺伝学的アプローチを使用してください。我々は、器官培養の準備（; 5月8日、2,3 12,13,15-22）利用する。Stoppiniらのアプローチ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、卓越した技術支援のために真弓桜庭とレベッカFoehringに感謝します。さらに、我々は博士に感謝します。トランスフェクションのためのcDNA構築物を弊社に提供するための器官スライス培養と遺伝子銃トランスフェクションプロトコールと博士ジャンヌNerbonneの実装の支援のためのロドリゴAndradeさん。 NINDS（RCFまで）からNS044163：この作品は、NIHの助成金によってサポートされていました。

Materials

Surgery / transfection / culture:

  1. Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  2. Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
    • Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
    • disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
      • 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
      • Tefzel Tubing: #165-2441
  3. Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984- 3766).

Media:

  1. Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  2. HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  3. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  4. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  5. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
  6. Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
  7. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)

Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Recording:

  1. Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
  2. Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
  7. IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).
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Referências

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Whole Cell RecordingOrganotypic Slice PreparationNeocortexVoltage-gated Potassium ChannelsPyramidal NeuronsGenetic ApproachOrganotypic Culture PreparationLaminar Pattern Of CortexAcute Neocortical SlicesVisually-identified Pyramidal NeuronsInfrared IlluminationDifferential Interference Contrast MicroscopyWhole Cell Patch ClampCurrent-clampVoltage-clampBiolistic TransfectionWild Type Potassium Channel DNAMutant Potassium Channel DNAFunction StudyEpifluorescence MicroscopyGreen Fluorescent Protein (GFP)Adjacent Untransfected Neurons

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Citar este artigo
Foehring, R. C., Guan, D., Toleman, T., Cantrell, A. R. Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex. J. Vis. Exp. (52), e2600, doi:10.3791/2600 (2011).
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