Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex
Summary
C'est un protocole pour préparer et maintenir une préparation de tranches de néocortex culture organotypique dans le but de réaliser des enregistrements électriques des neurones pyramidaux.
Abstract
Nous avons étudié les rôles d'expression et fonctionnelles des canaux voltage-dépendants de potassium dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat. En raison de l'absence d'agents pharmacologiques spécifiques pour ces canaux, nous avons pris une approche génétique de la manipulation de l'expression des canaux. Nous utilisons une préparation culture organotypique (16) afin de maintenir la morphologie cellulaire et le modèle laminaire du cortex. En général, nous isoler aiguë tranches néocorticales à 8-10 jours post-natal et de maintenir les tranches en culture pendant 3-7 jours. Cela nous permet d'étudier les neurones à un âge similaire à ceux de notre travail avec des tranches aiguës et minimise le développement des connexions excitatrices exubérante dans la tranche. Nous enregistrons d'identifier visuellement les neurones pyramidaux des couches II / III ou V à l'aide d'éclairage infrarouge (IR-) et microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) avec pince de cellules de patch tout en courant ou voltage-clamp. Nous utilisons biolistique (canon à gènes) transfection de type sauvage ou mutante ADN canal potassique de manipuler l'expression des canaux d'étudier leur fonction. Les cellules transfectées sont facilement identifiables par microscopie à épifluorescence après co-transfection avec l'ADNc pour la protéine fluorescente verte (GFP). Nous comparons les enregistrements de cellules transfectées à proximité, les neurones non transfectées dans la même couche de la même tranche.
Protocol
Discussion
Nous avons étudié les rôles d'expression et fonctionnelles des canaux voltage-dépendants de potassium dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat (4, 9-11). En raison de l'absence d'agents pharmacologiques spécifiques pour ces canaux, nous utilisons une approche génétique pour manipuler l'expression de canal (1,14,15,17-19). Nous utilisons une préparation culture organotypique (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modifiée de l'approche de Stoppini et al (16), afin de maintenir la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Mayumi Sakuraba et Rebecca Foehring d'assistance technique exceptionnelle. En outre, nous tenons à remercier les Drs. Rodrigo Andrade pour l'aide à mettre en œuvre la culture organotypique et des protocoles de transfection biolistique et le Dr Jeanne Nerbonne pour nous fournir avec des constructions d'ADNc pour la transfection. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant: NS044163 du NINDS (aux FCR).
Materials
Surgery / transfection / culture:
- Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
- Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
- Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
- Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
- disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
- 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
- Tefzel Tubing: #165-2441
- Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984- 3766).
Media:
- Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
- HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
- Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
- 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording:
- Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
- Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
- Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
- Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
- IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).
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