تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة
Summary
هذا هو بروتوكول لإعداد والحفاظ على القشرة المخية الحديثة في إعداد شريحة الثقافة عضوي النمط لغرض صنع التسجيلات الكهربائية من العصبونات الهرمية.
Abstract
لقد تم دراسة الأدوار الوظيفية للتعبير والجهد بوابات قنوات البوتاسيوم في الخلايا العصبية المخية الحديثة هرمي من الفئران. بسبب عدم وجود وكلاء الدوائية محددة لهذه القنوات ، اتخذنا نهجا وراثية لمعالجة التعبير القناة. نستخدم إعداد عضوي النمط الثقافة (16) من أجل الحفاظ على التشكل الخلية ونمط الصفحي من القشرة. نحن عادة عزل شرائح القشرة المخية الحديثة الحادة في 8-10 أيام بعد الولادة ، والحفاظ على شرائح في الثقافة لمدة 3-7 أيام. وهذا يسمح لنا لدراسة الخلايا العصبية في سن مماثلة لتلك التي في عملنا مع شرائح الحادة ، ويقلل من تطور مثير للاتصالات مندفعا في شريحة. نسجل من العصبونات الهرمية بصريا المحددة في طبقات الثاني / الثالث أو الخامس الإضاءة باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) وعلى النقيض التدخل التفاضلية المجهري (DIC) مع كل خلية في المشبك التصحيح الحالي أو المشبك الجهد. نستخدم biolistic (بندقية الجينات) من نوع ترنسفكأيشن البرية أو متحولة قناة البوتاسيوم الحمض النووي لمعالجة التعبير عن قنوات للدراسة وظائفها. يتم التعرف عليها بسهولة بواسطة الخلايا transfected المجهري epifluorescence بعد ترنسفكأيشن بالتعاون مع [كدنا] لبروتين الفلورية الخضراء (GFP). قارنا تسجيلات من الخلايا إلى الخلايا العصبية transfected ، untransfected المجاورة في نفس الطبقة من شريحة واحدة.
Protocol
Discussion
لقد تم دراسة الأدوار الوظيفية للتعبير والجهد بوابات قنوات البوتاسيوم في الخلايا العصبية المخية الحديثة هرمي من الفئران (4 ، 9-11). بسبب عدم وجود وكلاء الدوائية محددة لهذه القنوات ، ونحن نستخدم منهج التعبير الجيني لمعالجة القناة (1،14،15،17-19). نحن نستخدم استعدادا الثقافة ع…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ومايومي Sakuraba Foehring ريبيكا لتقديم المساعدة التقنية العالقة. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر الدكاترة. رودريغو اندرادي للمساعدة في تنفيذ عضوي النمط ثقافة شريحة والبروتوكولات ترنسفكأيشن biolistic والدكتور جين Nerbonne لتزويدنا يبني لترنسفكأيشن [كدنا]. وأيد هذا العمل عن طريق منح المعاهد الوطنية للصحة : من NS044163 NINDS (لإطار التعاون الإقليمي).
Materials
Surgery / transfection / culture:
- Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
- Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
- Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
- Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
- disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
- 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
- Tefzel Tubing: #165-2441
- Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984- 3766).
Media:
- Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
- HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
- Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
- 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording:
- Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
- Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
- Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
- Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
- IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).
Referências
- Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
- Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
- Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).
- Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons. Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
- Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue. Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).
- Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones. J Physiol. 571, 371-389 (2006).
- Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).
- Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons. J Physiol. 581, 941-960 (2007).
- Johnson, H. A., Buonomano, D. V. A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes. Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).
- Johnson, H. A., Buonomano, D. V. Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices. J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).
- Malin, S. A., Nerbonne, J. M. Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).
- O’Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons. J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).
- Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons. J Neurochem. 75, 882-885 (2000).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- O’Brien, J. A., Lummis, S. C. Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun. Nat Proc. 1, 977-981 (2006).
- Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
- Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. . J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).
