FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

1. Lisis y Difusión de un núcleo de una biopsia de blastómeros Buffer de lisis celular de las células de la difusión (0,2% de Tween 20 en 0,01 M de HCl, pH 2,0) deben estar preparados 24 horas de antelación y se almacenan a -20 ° C. La preparación de 100 ml y filtrar 20 en un recipiente estéril de 30 ml universal, utilizando una aguja estéril jeringa de 20 ml y el filtro de la jeringa. Dispensar alícuotas de 1 ml en tubos de 1,7 ml 10-15 estéril de microcentrífuga, cierre y etiqueta de los tubos antes de la congelación. Es recomendable contar con dos lotes diferentes es el uso, el nuevo lote y el lote anterior, lo que ha sido probado y se puede utilizar si el nuevo grupo no es satisfactoria. Descongele el tampón de lisis a temperatura ambiente 30 minutos antes de la biopsia. A efectos prácticos la temperatura de trabajo será entre la temperatura ambiente y temperatura de la mano. Marca un círculo pequeño (aproximadamente 5 mm de diámetro) en la parte inferior de una diapositiva amina recubiertos (por ejemplo, Genetix) utilizando una pluma de diamantes y la etiqueta antes de la diapositiva con el número de caso, número de la diapositiva única, y la fecha de la biopsia. Utilice una diapositiva por separado para cada blastómero en orden numérico, y la etiqueta con el número de embriones. Las diapositivas deberán estar etiquetados con un lápiz duro como 4H, y "borrado" con un guante de látex para eliminar el polvo de grafito. Coloque una pequeña cantidad de solución amortiguadora de lisis dentro del círculo. La transferencia de la biopsia de blastómeros en el tampón de lisis. Si es necesario agregar solución amortiguadora de lisis dentro del círculo hasta que la célula comienza a lisar, lisis de la célula debe por completo y el citoplasma se dispersan antes de que se seque el buffer. Observe el núcleo para asegurar que se mantiene dentro del círculo y no se pierde, y si el celular no tiene un núcleo o tiene múltiples núcleos, la biopsia otra celda. Salga de la diapositiva se seque al aire a temperatura ambiente. 2. Hibridación in situ en un núcleo único blastómeros Prepare una serie de etanol (70, 90 y 100%) prepararse en agua destilada estéril. Activar y configurar el bloque de calor (por ejemplo, Hybaid Omnislide o Hybrite Vysis) a 75 ° C. Descongele las sondas, vortex y centrifugar. Los reactivos deberán ser testigo y se comprueba su correcto antes de hacer la mezcla de sondas. Pipeta volúmenes según lo especificado por el fabricante para hacer la mezcla de la sonda en un tubo de microcentrífuga de 0,65 ml estéril y agitar y centrifugar antes de su uso. El volumen total de la mezcla de la sonda debe ser suficiente para permitir que l 2 por núcleo para ser probado y se redondea con una precisión de 10 l para permitir un margen de seguridad. Pre-lavado de los portaobjetos en jarras Coplin con tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) por 5 min a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos dos veces en agua destilada estéril. Deshidratar las diapositivas con la serie de etanol (70, 90 y 100%) durante 2 minutos cada uno, a temperatura ambiente y el aire seco. Asegúrese de que las diapositivas se sumerge por completo y si el polvo de grafito flota a la superficie, cubra con un paño limpio. Registrar la posición del núcleo dentro del círculo mediante la visualización con un microscopio de contraste de fase. Deshidratan con etanol al 100% durante 2 min a temperatura ambiente y el aire seco. Aplicar 2 l de la mezcla de la sonda, y cubrir con un cubreobjetos de 9 x 9 mm (un cuarto de 18 x 18 mm cubreobjetos n º 1). Sellar los bordes del cubreobjetos con goma de cemento (por ejemplo, goma de vaca, de corrección de la vaca). Codenature las diapositivas en un bloque caliente a 75 ° C durante 5 minutos, y después se hibridan las diapositivas durante la noche (16-20 h) en una cámara húmeda a 37 º C. Mezcla de la sonda que consisten enteramente de las sondas centrómero (es decir, ligada al sexo de los casos), dará un resultado satisfactorio después de 60 minutos de la hibridación. Prepare un baño de agua con suficientes recipientes de Coplin y el calor a 71 ° C. Preparar un 0,4 x citrato salino estándar (SSC) de solución de lavado estrictas (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mm C 6 H 5 O 7 Na 3 .2 H 2 O) y el calor en el baño de agua. Vierta 50 mL de lavado estrictas por frasco Coplin necesario y comprobar que la temperatura es de 71 ° C inmediatamente antes de su uso mediante un termómetro limpio. Retire con cuidado el cemento de caucho de cada diapositiva y enjuagar el cubreobjetos con 4x SSC/0.05% de Tween 20 (pH 7,0) a temperatura ambiente. Se lavan los portas en el lavado de 0,4 x SSC estrictos a 71 ° C durante 5 min. Lavado de no más de 6 diapositivas por jarra de Coplin. Se lavan los portas en Tween20 4x SSC/0.05% a temperatura ambiente durante 2 min. Si la mezcla contiene la sonda sonda indirectamente etiqueta (s), la fuga de las diapositivas de exceso de líquido y aplicar 20 L de anticuerpo conjugado con fluorescencia en un cuadrado de 20 x 20 mm de Parafilm. Incubar en una cámara húmeda a 37 ° C durante 15 min. Retire el Parafilm y lavar de vez en Tween20 4x SSC/0.05% a temperatura ambiente durante 2 min. Lavar dos veces durante 2 minutos en PBS unat la temperatura ambiente y de drenaje de las diapositivas. Aplique 6 l de DAPI / Vectashield (160 ng de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihidrocloruro de 1 mL de medio de montaje Vectashield, Vector Laboratories) a un 22 x 22 mm no. 0 cubreobjetos y se invierte el portaobjetos sobre el cubreobjetos. Blot y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. 3. Análisis utilizando un microscopio de fluorescencia debidamente equipados con los filtros adecuados para las sondas utilizadas. Señales de puntuación mediante la visualización directa utilizando un microscopio de fluorescencia y un solo filtros pasa banda para cada fluorocromo en el ensayo. Cada núcleo debe ser anotado por dos analistas. Como regla general, debe conducir a la puntuación de una sola señal en dos señales muy próximas entre sí menos de un dominio (la señal de ancho) de distancia, sin embargo, el juicio basado en la experiencia debe ser ejercido para interpretar las señales de diferente tamaño, intensidad, y la separación. El uso del software de imágenes (por ejemplo, Isis, MetaSystems, Altlußheim, Alemania; CytoVision, Genetix) para capturar una imagen del núcleo de la confirmación del diagnóstico visual y archivo de imágenes como parte de un plan de garantía de calidad de laboratorio. 4. Los resultados representativos: Metafase y núcleos en interfase de cultivo de linfocitos de sangre periférica debe ser examinado para confirmar que las sondas seleccionadas son específicas para los cromosomas de translocación, informativo de los puntos de ruptura (las sondas de hibridación subtelomere debe sólo a los segmentos de translocación y la sonda centrómero (s) a la céntrica segmento (s)) y las señales de los núcleos en interfase debe ser brillante y discreto. Anotar el número de señales para cada sonda en 100 núcleos en interfase de cada socio, se recomienda evaluar la eficiencia de la prueba. En este caso, dos señales se anotó en el 95% -99% de los núcleos de cada sonda. La figura 1 muestra una metafase y el núcleo de la interfase de una preparación para una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas 5 y 9. Las señales en los núcleos en interfase de blastómeras de embriones debe ser brillante y discreto y anotó con distintos filtros de paso de banda de los colores utilizados. La figura 2 muestra un núcleo blastómero con un patrón de señal normal (2 copias de todos los loci a prueba), en consonancia con un complemento cromosómico normal o equilibrado para el cromosoma 5 y 9, y un núcleo con un patrón de señal anormal en consonancia con un producto de la translocación desequilibrada que ha monosomía (una copia) para el segmento translocado del cromosoma 5 y la trisomía (tres copias) para el segmento translocado del cromosoma 9. Figura 1 Una extensión metafase y una interfase núcleo preparado a partir de cultivos de linfocitos de sangre periférica de un portador de una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas 5 y 9, con puntos de interrupción en 5p14.3 y 9p24.1:. 46, XY, t (5 , 9) (p14.3;. p24.1) ISH t (5; 9) (5ptel48, 9ptel30 +; 9ptel30, 5ptel48 +, 9cen +). Sondas de FISH fueron seleccionados para ambos segmentos translocados (5p14.3 → 5pter, rojo Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) y el segmento centrado en el cromosoma 9 (9p24.1 → 9qter, azul Abbott CEP 9 alfa satélite SpectrumAqua). Señales de la figura 2. Núcleos en interfase blastómero de tres días-embriones capturado utilizando un filtro diferente para cada fluorocromo y se fusionaron para formar una imagen compuesta. (A) dos señales para cada sonda que indica dos copias de cada lugar, lo cual es consistente con un complemento normal o equilibrado de los cromosomas de translocación. (B) Una luz roja, tres señales de color verde y dos señales de color azul indicando una copia del segmento translocado del cromosoma 5, tres copias del segmento translocado del cromosoma 9 y dos copias del segmento centrado del cromosoma 9, lo cual es consistente con la adyacente -1 segregación de la translocación que resulta en un producto desequilibrado con monosomía para 5p14.3 → 5pter y la trisomía para 9p24.1 → 9pter.