FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

1. Lisi e diffondere un nucleo da una biopsia di blastomeri Buffer di lisi cellulare per diffusione di cellule (0,2% Tween20 di 0,01 M HCl, pH 2,0) deve essere preparato 24 ore di anticipo e conservati a -20 ° C. La preparazione di 100 ml e filtrare 20 ml in un contenitore sterile da 30 ml universale usando una siringa da 20 ml sterile e filtro siringa. Dispensare 1 ml di aliquote in 15/10 1,7 mL microcentrifuga sterili, chiudere ed etichettare le provette prima del congelamento. Si raccomanda di avere due partite diverse è uso, il nuovo lotto e il lotto precedente, che è stato testato e può essere utilizzato se il nuovo lotto non è soddisfacente. Sbrinare il tampone di lisi a temperatura ambiente 30 minuti prima della procedura di biopsia. Ai fini pratici, la temperatura di esercizio sarà tra temperatura ambiente e temperatura della mano. Punteggio ottenuto un piccolo cerchio (circa 5 mm di diametro) sul lato inferiore di una ammina rivestite scorrimento (ad esempio Genetix) utilizzando una penna di diamante e pre-etichetta la diapositiva con il numero del caso, numero di diapositiva unico, e data la biopsia. Utilizzare un vetrino separato per ogni blastomero in ordine numerico, e l'etichetta con il numero degli embrioni. Vetrini devono essere etichettati con una matita dura come 4H, e "cancellati" con un guanto in lattice per rimuovere la polvere di grafite. Mettere un piccolo volume di tampone di lisi all'interno del cerchio. Trasferire il blastomero biopsia nel buffer di lisi. Se necessario aggiungere tampone di lisi all'interno del cerchio fino a quando la cellula comincia a lisare, la cellula deve lisare completamente e il citoplasma disperdersi prima che si asciughi buffer. Osservare il nucleo di modo che esso rimanga all'interno del cerchio e non è perduto, se la cella non ha un nucleo o ha nuclei multipli, biopsia un'altra cella. Lasciare il vetrino asciugare all'aria a temperatura ambiente. 2. Ibridazione in situ di un nucleo singolo blastomero Preparare una serie di etanolo (70, 90 e 100%) costituita in acqua distillata sterile. Attivare e impostare il blocco caldo (ad esempio Hybaid Omnislide o Vysis Hybrite) a 75 ° C. Sonde di sbrinamento, vortice, e centrifuga. I reagenti devono essere assistito e verificato di essere corretto prima che compongono la miscela della sonda. Volumi pipetta come specificato dal costruttore per costituire la miscela della sonda in una provetta da microcentrifuga 0,65 ml sterile e vortex e centrifugare prima dell'uso. Il volume totale della miscela sonda dovrebbe essere sufficiente per consentire 2 microlitri per ogni nucleo da testare e arrotondato al più vicino 10 microlitri per consentire un margine di sicurezza. Prelavaggio i vetrini in vaschette Coplin con tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,0: 0,14 M di NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) per 5 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini due volte in acqua distillata sterile. Disidratare le diapositive con la serie di etanolo (70, 90 e 100%) per 2 minuti ciascuna a temperatura ambiente e aria secca. Garantire scivoli sono completamente immersi e se la polvere di grafite galleggia in superficie, assorbire con un panno pulito. Registrare la posizione del nucleo all'interno del cerchio da visualizzare con un microscopio a contrasto di fase. Disidratare con il 100% di etanolo per 2 minuti a temperatura ambiente e aria secca. Applicare 2 l di miscela della sonda, e coprire con un 9 x 9 millimetri coprioggetto (un quarto di un 18 millimetri x 18 n.1 coprioggetto). Sigillare i bordi del coprioggetto con gomma cemento (ad esempio Mucca Gum, correzione di mucca). Codenature i vetrini su un blocco calda a 75 ° C per 5 minuti, e poi ibridare le diapositive durante la notte (16-20 ore) in una camera umidificata a 37 ° C. Mescola sonda che è interamente costituita da sonde centromero (ad esempio per casi legato al sesso) darà un risultato soddisfacente dopo 60 min di ibridazione. Preparare un bagno d'acqua con sufficiente vaschette Coplin e calore a 71 ° C. Preparare una 0.4x citrato standard di soluzione salina (CSD), soluzione di lavaggio stringente (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M di NaCl, 6 mm C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) e di calore nel bagno d'acqua. Dispensare 50 ml di lavaggio stringente per Coplin vaso richiesti e controllare che la temperatura è 71 ° C immediatamente prima dell'uso con un termometro pulito. Rimuovere con cura il mastice di ogni diapositiva e risciacquare il coprioggetto utilizzando 4x SSC/0.05 Tween20% (pH 7,0) a temperatura ambiente. Lavare le diapositive nel lavaggio 0.4x SSC stringenti a 71 ° C per 5 min. Lavare non più di 6 diapositive per vaschetta Coplin. Lavare i vetrini in 4x Tween20 SSC/0.05% a temperatura ambiente per 2 min. Se la miscela contiene sonda sonda indirettamente etichettati (s), scaricare le diapositive del liquido in eccesso e applicare 20 l di anticorpo fluorescente coniugato con un 20 x 20 mm quadrati di Parafilm. Incubare in una camera umidificata a 37 ° C per 15 minuti. Rimuovere il Parafilm e lavare una volta in 4x Tween20 SSC/0.05% a temperatura ambiente per 2 min. Lavare due volte per 2 min in PBS, unt temperatura ambiente e drenare le diapositive. Applica 6 ml di DAPI / Vectashield (160 ng di 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato in 1 ml di terreno Vectashield montaggio, Vector Laboratories) ad un 22 x 22 mm cod. 0 coprioggetto e invertire il vetrino sopra il coprioggetto. Blot e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente. 3. Analisi utilizzando un microscopio a fluorescenza opportunamente attrezzato di appositi filtri per la sonde utilizzate. Segnali punteggio visualizzazione diretta utilizzando un microscopio a fluorescenza e singoli filtri passa-banda per ogni fluorocromo nel saggio. Ogni nucleo dovrebbe essere segnato da due analisti. Una regola generale dovrebbe portare al gol di un segnale unico in cui due segnali molto vicine tra loro sono meno di un dominio (segnale di larghezza) a parte, tuttavia, il giudizio sulla base dell'esperienza deve essere esercitato per interpretare i segnali di varie dimensioni, intensità, e la separazione. Utilizzare software di imaging (ad esempio Iside, MetaSystems, Altlußheim, Germania; CytoVision, Genetix) per catturare un'immagine del nucleo per la conferma della diagnosi visiva, e per la archiviazione delle immagini come parte di un piano di assicurazione della qualità da laboratorio. 4. Rappresentante dei risultati: Metafase e nuclei interfasici da colture di linfociti del sangue periferico devono essere esaminati per verificare che le sonde selezionati sono specifici per traslocazione dei cromosomi, informativo per i punti di interruzione (le sonde subtelomere dovrebbero ibridarsi solo ai segmenti traslocato e la sonda centromero (s) al centrica segmento (s)) e dei segnali in nuclei interfasici deve essere brillante e discreto. Segnando il numero di segnali per ogni sonda in 100 nuclei interfasici da ogni partner si consiglia di valutare l'efficacia del test. In questo caso 2 segnali sono stati segnati nel 95% -99% dei nuclei per ciascuna sonda. La figura 1 mostra una metafase e nucleo interfase da una preparazione per una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi 5 e 9. Segnali in nuclei interfasici da blastomeri dell'embrione deve essere brillante e discreto e valutato con separato filtri passa banda per i colori utilizzati. La Figura 2 mostra un nucleo blastomero con un modello normale segnale (2 copie per tutti i loci testati) coerenti con un corredo cromosomico normale o bilanciato per il cromosoma 5 e 9, e un nucleo con un modello di segnale anomalo in linea con un prodotto della traslocazione sbilanciata che ha monosomia (una copia) per il segmento del cromosoma 5 traslocato e trisomia (3 copie) per il segmento traslocato del cromosoma 9. Figura 1 Uno spread metafase e un nucleo interfase preparati da colture di linfociti del sangue periferico da un portatore di una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi 5 e 9 con punti di interruzione in 5p14.3 9p24.1 e:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +);. 9) 5ptel48-, 9ptel30 + ( Sonde FISH sono stati selezionati per entrambi i segmenti traslocato (5p14.3 → 5pter, rosso Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) e il segmento centrica del cromosoma 9 (9p24.1 → 9qter, blu Abbott CEP 9 alfa satellite SpectrumAqua). Segnali Figura 2. Nuclei in interfase blastomero dal primo giorno-3 embrioni catturate utilizzando un filtro diverso per ogni fluorocromo e uniti per formare un'immagine composita. (A) due segnali per ogni sonda indicare due copie di ogni luogo, che è coerente con un complemento normale o bilanciato per traslocazione dei cromosomi. (B) Un segnale rosso, tre segnali verdi e due segnali blu che indica una copia del traslocato segmento del cromosoma 5, tre copie del segmento di traslocazione del cromosoma 9 e due copie del segmento centrica del cromosoma 9, che è coerente con adiacente -1 segregazione della traslocazione determinando un prodotto non bilanciato con monosomia per 5p14.3 → 5pter e la trisomia per 9p24.1 → 9pter.