Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

1. Plasmide Transformatie van Target cDNA Deel I: Transformatie van plasmide (Duur: 3 uur plus een nacht incubatie) Warm SOC voedingsstof bouillon in een 42 ° C waterbad (500 pi per reactie) Dooi competente cellen op ijs Voeg 1 ui plasmide tot 25 uL competente cellen Plaats op ijs gedurende 20 minuten Heat shock cellen in 42 ° C waterbad gedurende 45 seconden Onmiddellijk plaats cellen op ijs gedurende 2 minuten Voeg 500 ul van 42 ° C voedingsstoffen bouillon aan elke flacon van cellen Schudden bij 37 ° C gedurende 2 uur bij 255 omwentelingen per minuut (rpm) Plaat 75 pi transformatie mix op Luria Bertani (LB) agar platen Incubeer de platen omgekeerd bij 37 ° C gedurende de nacht Deel II: E. coli Cultuur (Verplicht Tijd: 15 minuten plus een nacht incubatie) Voor elke reactie, aliquot 3 ml LB bouillon en 3 pi van 50 mg / ml ampicilline in een cultuur buis Schraap een bacterie kolonie van de agar plaat en toe te voegen aan elke cultuur buis Schud kweekbuizen bij 37 ° C bij 255 rpm 's nachts Deel III: Plasmide-Prep (Duur: 1,5 uur) Isoleer plasmide van girale culturen het gebruik van de 5-premier FastPlasmid Mini Kit (Catalog # 2300000) Om te controleren op de aanwezigheid van voorbereide plasmide, voert het DNA geëlueerd uit de kit op een 1% Tris-acetaat-EDTA (TAE) gel gekleurd met ethidiumbromide 2. In Situ DIG-gelabelde RNA-Probe Synthese Deel I: Linearisatie van plasmide (Verplicht Tijd: 2,5 uur) In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren: Bereid Plasmide 20 ml Restrictie-enzym * 2 mL Buffer ** 10 ml 10X Bovine Serum Albumine (BSA) 10 ml Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Water 58 ml 100 ml Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur * Varieert met plasmide ** Varieert met restrictie-enzym Deel II: Transcriptie (Verplicht Tijd: 3 uur) In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren: Lineaire plasmide 4 mL 10X Transcriptie Buffer ** 4 mL Digoxigenine Label Mix 4 mL Polymerase * 2 mL RNase Inhibitor 2 mL DEPC Water 24 ml 40 ml Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur Voeg 2 ul van polymerase * Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur Voeg 2 ul van DNase Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten * Varieert met plasmide ** Varieert met polymerase Deel III: Neerslag (Benodigde tijd: 5 minuten plus 2 uur tot 's nachts incubatie, 1 uur naar centrifuge en resuspendeer) Voeg 4 ul van 0,2 M EDTA Voeg 5 ul van 4M lithiumchloride Voeg 150 ul van ijskoude 100% ethanol Incubeer bij -80 ° C gedurende 2 uur om 's nachts Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C, giet af supernatant Droge pellet voor 7 minuten Re-schorten in 20 uL DEPC water Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten Deel IV: Fractionation – alleen uitvoeren als probe grootte is groter dan 0,6 kb (Duur: varieert op basis van probe grootte, meestal niet meer dan 20 minuten) In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren: RNA Probe 20 ml DEPC Water 12 ml Natriumbicarbonaat 4 mL Natriumcarbonaat 4 mL 40 ml Incubeer in een 60 ° C waterbad. Basis van de incubatietijd van de vergelijking: Tijd (min.) = (vanaf kb – gewenste kb) / (0,11 x vanaf kb x gewenste kb) Gemiddelde gewenste size = 0,6 kb Deel V: Final Neerslag (Benodigde tijd: 5 min.nuten plus 2 uur tot 's nachts incubatie, 1 uur naar centrifuge en resuspendeer, 1 uur voor gelelektroforese) Voeg 40 ul DEPC water Voeg 8 ul Natriumacetaat Voeg 1,04 ul ijsazijn Voeg 240 ul ijskoude 100% ethanol Incubeer bij -80 ° C gedurende 2 uur om 's nachts Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C, giet af supernatant Droge pellet voor 7 minuten Re-schorten in 20 uL DEPC water Vortex te mengen Om te controleren op de aanwezigheid van riboprobe, voer het opnieuw opgehangen oplossing op een 1% TAE gel gekleurd met ethidiumbromide 3. Hele berg in situ hybridisatie Deel I: Fixatie van embryo's en Proteinase K Spijsvertering (Tijd Vereist: Fix 's nachts plus vier uur de volgende dag voor de opslag, 2,5 uur van opslag naar deel II) Verzamel geënsceneerde zebravis embryo's en 's nachts vast te stellen in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C Was vast embryo's in fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween-20 (PBST) 3 keer voor 10 minuten elk Om de blootstelling van de embryo's om de experimentele reagentia, handmatig dechorionate embryo's (indien nodig) met behulp van fijne punt pincet zorgen Uitdrogen embryo's door wassen in een gegradeerde serie van 25% en 50% methanol in PBST gedurende een uur elke wasbeurt, op te slaan in 100% methanol bij -20 ° C Wanneer klaar voor gebruik, hydrateren embryo's in PBST door wassen in 50% (2 maal) en 25% (1 keer) methanol in PBST gedurende 10 minuten elk. Tot slot was twee keer voor 10 minuten elk in 100% PBST. Exacte timing is niet belangrijk voor PBST / methanol wast Bleach embryo's in een 10% waterstofperoxide-oplossing in PBST, indien nodig, donkere pigmenten te verwijderen. Embryo's broeden in waterstofperoxide-oplossing voor 10-20 minuten, afhankelijk van de leeftijd van het embryo, en de dop van de microfugebuis moet open blijven voor-opbouw te voorkomen van de luchtdruk Digest embryo's met 50 mg / ml proteïnase K verdund 1:5000 in PBST voor 3-15 minuten, afhankelijk van de leeftijd van het embryo Re-fix embryo's in 4% PFA gedurende 30 minuten, en daarna wassen 3 keer in PBST gedurende 5 minuten per Deel II: Hybridisatie van riboprobes (Duur: 3 uur plus 's nachts voor hybridisatie, 1,5 uur de volgende dag naar deel III) Prehybridize embryo's met prehybridisatie oplossing (PHS) in een voorverwarmde 70 ° C waterbad gedurende 2-3 uur Verwijder de PHS, voeg 0,5 ml hybridisatie-oplossing en 1,5 pi eerder gesynthetiseerd digoxigenine gelabeld riboprobes, incuberen bij 70 ° C gedurende de nacht. De temperatuur kan schommelen binnen een paar graden, afhankelijk van de riboprobe doel De volgende dag, wassen embryo's bij 70 ° C in gegradeerde oplossingen van 75%, 50% en 25% PHS in 2X zoutoplossing-natriumcitraat (SSC) voor 10 minuten elk, daarna wassen in 0,2 X SSC gedurende 30 minuten bij 68 ° C Was in maleïnezuur Buffer (MAB) 2 keer voor 10 minuten elk bij kamertemperatuur Deel III: Anti-digoxigenine (α-DIG) antilichaam Incubatie (Duur: 3 uur plus 's nachts te blokkeren, 2,5 uur de volgende dag naar deel IV) Transfer embryo's om een ​​12 wells plaat Pre-block embryo's in 1-2 mL oplossing voor het blokkeren van minimaal 3 uur bij kamertemperatuur Tegelijkertijd, pre-blok het antilichaam door het opstellen van een tweede deel van het blokkeren van oplossing en verdunnen van de anti-digoxigenine antilichaam 1:2000 in deze oplossing Verwijder de pre-block en voeg 1-2 ml pre-geblokkeerde α-DIG-oplossing, overnachting incuberen bij 4 ° C De volgende dag, wassen embryo's in MAB. Laat de embryo's in MAB incubeer gedurende 5 minuten, daarna voer een buffer verandert en incubeer gedurende 10 minuten twee, een 30 minuten en een 60 minuten interval. Exacte timing is niet nodig Was de embryo drie keer voor vijf minuten elk in alkalische fosfatase (AP) buffer Deel IV: Beitsen en nabewerking (Duur: 1 uur tot 's nachts voor vlekken, afhankelijk van de gebruikte riboprobe, kan vier uur tot het begin van glycerol wast, 6-10 uur per glycerol wassen, worden opgeslagen in glycerol) Voeg 1-2 ml kleuroplossing om de embryo's, wikkel de plaat in folie en controleer vlekken op regelmatige tijdstippen (ongeveer om de 20 minuten) tot kleuring is voldoende Was de embryo's met PBST 2 keer voor 5 minuten om de kleuring reactie te stoppen Uitdrogen embryo's met behulp van 10 minuten wast in 25% (1 keer) en 50% (2 keer) methanol in PBST, dan is in 100% methanol, op de achtergrond te verwijderen vlekken Laat embryo's in 100% methanol incubeer gedurende minstens 2 uur bij kamertemperatuur Hydrateren in PBST met behulp van 10 minuten wast in 50% (2 maal) en 25% (1 keer) methanol in PBST, daarna wassen in 100% PBST twee keer Overdracht gebrandschilderde embryos tot een 80% glycerol oplossing in PBST, met behulp van een getrapte reeks van wast, en bewaar bij 4 ° C. Recepten: LB agar platen-10 g LB-agar + 250 ml gedestilleerd water, autoclaaf, bij koel aan toe te voegen 250 uL ampicilline, giet 15-20 ml warme oplossing in elke petrischaal, laat agar stollen LB bouillon-12,5 g LB bouillon + 200 ml gedestilleerd water, autoclaaf, laat afkoelen voor gebruik 1% TAE gel-0.4 g agarose, 40 ml 1x TAE, 2 pL ethidiumbromide; belasting zeven pi plasmide (Plasmide Transformatie van Target cDNA) of 3 pi riboprobe en 4 pi DEPC water (in situ DIG-gelabelde RNA-Probe Synthesis) + 1 ui laden kleurstof, 5 ul DNA-ladder Prehybridisatie oplossing-50% formamide, 5x SSC, 9.2mM citroenzuur, 1% Tween-20 Hybridisatie-oplossing-prehybridisatie oplossing plus 500 ug / ml tRNA en 50 ug / ml heparine MAB-100mm maleïnezuur, 150mm NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, pH tot 7,5 Het blokkeren van Solution-3 delen MAB, 1 deel 10% Boehringer het blokkeren van reagens in MAB, een deel warmte gedeactiveerd lam serum AP buffer-60mm Tris-HCl pH 9,5, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2, 0,1% Tween-20 Kleuroplossing-5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat (BVIE) en Nitro blauw tetrazolium (NBT) in AP buffer 4. Representatieve resultaten Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, zal de reactie tussen de NBT, BCIP, en alkalische fosfatase vormen een paarse neerslag die moet op de zebravis embryo verschijnen als een paarse vlek. Riboprobes moet eerder worden gesynthetiseerd uit cDNA dat correspondeert met het gen van belang. Daarom kan worden geconcludeerd enige smet gevisualiseerd vertegenwoordigt gebieden van de zebravis, waarin het gen van belang is getranscribeerd op die bepaalde ontwikkelingsfase. Voor de toepassing van deze cursus werden riboprobes gesynthetiseerd uit aldh1a2 (voorheen raldh2; Begemann et al., 2001;. Figuur 1); fgf8a (Reifers et al., 1998;. Figuur 2); deltaC (Oates et al., 2005.); myod1 (Weinberg et al., 1996.) shha (. Krauss et al., 1993), pax2a (Brand et al., 1996;. figuur 3) en myl7 (voorheen cmlc2;. Yelon et al., 1999) cDNA. Kleuring werd verwacht in de middellijn en in de anatomische structuren met inbegrip van de somieten, tailbud, myotoom, hersenen en het hart. Ace/fgf8a mutanten werd verwacht dat ze gebreken in veel van deze structuren. Kleuring werd makkelijk kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een standaard dissectiemicroscoop. Aanvullende bronnen bevatten meer informatie en het oplossen van problemen aan de wensen van technieken die vergelijkbaar zijn met de hier beschreven (Clark, 2003;. D'Costa et al., 2009; Schmoldt et al., 2009;. Schoenwolf, 2009). Figuur 1. Een zebravis embryo 24 uur na de bevruchting, die is gehybridiseerd met riboprobes specifiek voor aldh1a2. Specifieke kleuring is te zien in de ogen, achterhersenen, borstvin knop primordia, en somieten. Anterior is naar de top, posterior is naar de bodem. Figuur 2. Een zebravis embryo bij de 13 somiet stadium van de ontwikkeling die is gehybridiseerd met een probe specifiek voor fgf8a. Specifieke kleuring is te zien in de telencephalon, dorsale diencephalon, middenhersenen-achterhersenen grens, somieten, en tailbud. Ventraal is naar links, dorsale is aan de rechterkant. Figuur 3. A 22 uur na de bevruchting zebravis embryo dat is gehybridiseerd met een riboprobe specifiek voor pax2a, een robuuste marker nuttig voor het visualiseren van het zenuwstelsel. Specifieke kleuring kan worden gezien in het vaatvlies spleet, middenhersenen-achterhersenen grens, Otic blaasje, en het ruggenmerg neuronen. Dorsale bekijken met anterior aan de linkerkant.