压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

总论： 所有操作都应该执行下一个堂堂正正的解剖显微镜（奥林巴斯，与Z轴与曲柄STU2支架臂支架邮政SZX10），并通过使用一个手术凝固剂（11）。实验组应尽量可能在年龄和体重相匹配，以确保结果的可比性。 ，体温，血压，麻醉和流体管理应稳定。 1。麻醉和气管准备使用至少10周龄的C57BL / 6小鼠，并有22-25克的身体使用的剂量70毫克/公斤体重的IP（6）戊巴比妥钠诱导麻醉。保持约10毫克/公斤/小时戊巴比妥钠麻醉。小心过量，因为这可能会显着降低血压。给药苯巴比妥 – 即使小时，可导致血浆中的严重增加。 麻醉诱导后，在仰卧位表使用磁带和一期缝合固定脚踝上，下肢的安全小鼠。不要使用牙齿相同的头部。足够的限制是很重要的一个成功的插管和手术很好的控制。手术前，盖与矿物油鼠标，以减少鼠毛过敏的风险。为了确保体温保持稳定，与市售食品保鲜膜覆盖的小鼠。 广场小鼠加热温度控制表（RT，埃芬博格，慕尼黑，德国）与直肠温度计探头连接到热反馈控制器，以保持体温在37 ° C。 暴露的气管手术。解剖的结缔组织和地方两个3.0丝的手术缝合线（美国哈佛仪器，）每10厘米长气管下面的气管外侧和背两面。缝线应相距约1厘米。 小心切开气管3 – 4毫米以下使用麦弗逊式Vannas剪刀（8厘米，直叶片;世界精密仪器，美国）之间的两个圆形软骨喉。确保不引起出血，因为这可能会混淆的结果参数。 执行气管插管，使用钝的聚乙烯套管（Insyte 22G，Beckton Dickinson公司，美国）。聚乙烯套管插入进气管在一个85度角的尖端。然后倾斜套管，所以它是在与气管管腔。慢慢推进管进一步下降气管套管尖端直到消失在胸部光圈。在这个位置上，注视两种手术丝放置气管（见1.4）的背侧缝合管。 2。呼吸机相关性肺损伤的技术呼吸机连接管。为了诱导肺损伤，我们使用一个压力控制通风技术，通过使用来自西门子（DRE兽医，美国）伺服900 ℃。动物将使用一个FIO 2 = 1.0 45毫巴，频率80次/ min，吸气峰压0-3毫巴的压力呼气末正压通风。灵感到期的比例应是1:1。尽管伺服900℃是人类呼吸机内置的事实，其压力控制呼吸机设置使用作品的优秀小鼠的通风。 心率监测心电图（如惠普，blingen乙，德国）。确保心率不低于400。我们应该看到一个心轴右移，当机械通气作为胸腔内压力增加后，增加肺动脉压力的标志提起。如果鼠标的发展心动过缓，检查温度和麻醉剂的剂量/浓度。 Xylacin /氯胺酮麻醉诱导烂熟于心了250元/分钟，因此不推荐。 应用适当的补液。一个输液生理盐水0.1毫升/小时通过动脉或静脉导管之前进行通风，以确保足够的静脉备案。由于高的通风压力，静脉回流到心脏受损，可能导致的平均动脉压的关键下降。另外，500μL生理盐水静脉推注可给予手术前的IP。 放置在颈动脉血压（27）的连续录音导管。将手臂向身体，然后再开始解剖动脉。颈动脉是通过钝性分离气管肌肉暴露。经过进一步的接触和小心避免任何组织创伤（尤其是迷走神经），导管插入使用两个缝线和一个小钳（37）的船只。这将会使一个较长段的动脉。放置在颈动脉非常结扎。将较大的钳缝合结束，获得紧张或注视日发送缝合表使用磁带。将另一个周围动脉缝合动脉解剖的末端。在这里，放在一个小卡子。使用微型剪刀剪一小对角线开放到动脉。与罚款钳（杜蒙，WPI），保持开放和推进适当大小的导管，用你的手/钳。您的第二缝合打了一个结，安全的动脉。松开夹子，并进一步推进导管。安全与几节和磁带的导管。另外，颈内动脉导管可在实验结束的地方，收集动脉血血气分析样品。 3。组织样本的恢复经过3个小时的机械通气后，样品的采集，评估肺损伤的的程度。我们建议收集brochnoalveolar灌洗液（BAL），动脉血和肺组织。 在实验结束后获取BAL液。深化麻醉后，气管导管冲洗1毫升磷酸缓冲液（PBS）。流体应保持三秒钟之前，它是通过连接注射器回收气管/肺。的BAL管理单元冷冻在液氮中，并储存于-80 ° C，作进一步的分析。要知道，回收的量可能会大大超过1毫升。 在实验结束后进行血气分析。为了做到这一点，切口应低于胸骨。保持与产钳和程度的切口沿肋骨胸骨。接下来，膈肌切开边缘，从肋骨被切断。现在有一个较低的光圈到胸部开放的观点。提起胸骨钳和开放的胸部长在右侧和左侧的削减（尽可能横向），完整的前胸部墙被打开的病房。这应该做的，而实验动物仍然是机械通气。左心室被刺破了27 ½ G针和动脉血分析使用的i – STAT系统（美国雅培）。如果应进行动脉血气分析，不能取得一个平衡，因为这将是一个显着的混杂因素的结果。 除了上述方法，可以收集通过颈内动脉导管动脉血液样本。然而，这项工作应获得的BAL前。 海关肺部整块拉起的心脏和削减气管。有准备吸收血液中的一块组织，使手术部位可见。拉心在腹部的方向和沿脊柱小心切调动一切胸机关。切断主动脉，取出胸腔器官和它们放置在一个干净的手术台。 切去心脏和大血管的组织样本。确保没有胸腺组织仍然附着在肺。分开个别管和管理单元冻结的剪刀和地方的肺部。贮存于-80 ° C，作进一步的分析。 4。肺损伤的测量我们建议使用以下的结果参数评估肺损伤的程度：执行白蛋白酶联免疫吸附（Bethyl实验室，美国）和一个过氧化物酶（MPO）ELISA试剂盒（美国）Hycult生物技术，以评估屏障功能障碍的程度和炎症金额在BAL液中的细胞。执行一个MPO ELISA也形成肺组织。如果湿干比来衡量，我们没有获得BAL液和肺循环是没有刷新（见3.3）。测量切除后肺的重量。然后，肺部冻干48 h和肺组织再次测量。然后湿干比是衡量每毫克干组织的水（5）毫克。 图1。VILI 的小鼠BAL中的蛋白质含量与苯巴比妥麻醉，机械通气是制定和小鼠通风使用压力控制设置（吸气压力45毫巴，积极exspiratory最终压力3毫巴，100％的启发氧浓度）。后0，1，2和3小时的通风平衡是收获和使用bicinchoninic酸法（BCA法测定）的蛋白质含量进行了量化。蛋白质含量的相对变化是标准化方式显示为0小时的通风（N = 4每个组，*表示P <0.05与对照组比较，平均± SEM ）