התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

מתווה טיפוסי בניסוי התגבשות טווינה מוצגת תמונה 1 1,2. טרום התגבשות LCP-FRAP מבחני הם אופציונליים, אך הם יכולים להאיץ באופן משמעותי את התהליך של חיפוש אחר התנאים התגבשות ראשונית, במיוחד במקרה של חלבונים בממברנה קשה 3. 1. חלבון הכינון של LCP לטהר חלבון קרום עניין בתמיסת דטרגנט ולרכז את חלבון / אבקת מתחמי ל ~ 10-20 מ"ג / מ"ל, נזהרת שלא מעל לרכז את 1,4 חומר ניקוי. העברה ~ 25 מ"ג שומנים מארח LCP (בדרך כלל monoolein) או תערובת שומנים לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל ו לדגור על 40 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות עד השומנים נמס. צרף מצמד המזרק מזרק 100 גז חזק μL. טען את המזרק עם השומנים המותכת בעזרת פיפטה נפח מתכווננת. הקלט את עוצמת הקול של השומנים בתוך המזרק. עוד טען מזרק 100 μL עם פתרון חלבון ביחס חלבון פתרון ל-השומנים 2 / 3 v / נ חבר את שני מזרקים יחד דרך מצמד את המזרק. Push המזרק בוכנות לחילופין להעביר את השומנים והחלבונים באמצעות מחט הפנימי של מצמד, הלוך וחזור, עד mesophase שומנים הופכת הומוגנית. LCP צורות באופן ספונטני על ערבוב מכני, הופך את החלבון מחדש ב bilayer השומנים של LCP. כינונה של LCP יכול להיות מאומת על ידי עקביות שקוף דמוי ג'ל שלה על ידי בהעדר birefringency כאשר מתחת למיקרוסקופ מצויד צולבות מקטבים, או, אם אפשר, באמצעות זווית קטנה רנטגן עקיפה 1. 2. LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני LCP-FRAP מבחני נועדו למדוד את התכונות דיפוזיה של חלבונים בממברנה מחדש ב LCP במגוון של תנאי ההקרנה 3. דיפוזיה לטווח ארוך של חלבונים בממברנה של LCP חיונית התגבשות מוצלח, עם זאת, מיקרו של LCP מגביל דיפוזיה של חלבונים גדולים או אגרגטים חלבון oligomeric. סיבה נפוצה לכישלון של הניסוי התגבשות טווינה היא צבירת חלבון מהיר שמוביל לאובדן של דיפוזיה. הוכח כי התנהגות צבירה של חלבון תלוי לבניית חלבון מסוים, שומנים מארח את ההרכב של פתרון ההקרנה 3. לייבל את החלבון עם פלורסנט לצבוע (Cy3 או דומה) ביחס חלבון / צבע של ~ 100 / 1, להסיר את צבען unreacted ולרכז את החלבון ל ~ 1 מ"ג / מ"ל. תווית או אמינים חינם או thiols חינם. כאשר תיוג אמינים ללא תשלום, לשימוש pH בין 7 ל 7.5 ברובה התווית בחינם N-הסופית. שים לב תיוג אמינו יכול גם תווית שומנים שיתוף מטוהרים עם חלבון 2,3. לשחזר את החלבון שכותרתו LCP כמתואר בסעיף 1). הגדרת לוחות assay, כמתואר בסעיף 3) באמצעות LCP-FRAP פתרונות ההקרנה במקום מסכי התגבשות 2. דגירה צלחות ב 20 ° C בחושך במשך לפחות 12 שעות כדי להשיג מצב שיווי משקל. מקום אחד הלוחות בתחנת LCP-FRAP ולהתמקד הראשון גם באמצעות המטרה 10x. רוכשת 5 תמונות ניאון כדי ללכוד את המצב ההתחלתי מראש מולבן. טריגר הלייזר. כוח לייזר מספר פולסים צריך להיות מותאם אקונומיקה ~ 30 – 70% של חלבון הנקרא באמצע במקום מולבן. מיד לאחר מפעילה לייזר, להתחיל להקליט רצף מהיר שלאחר הלבנה של ~ 200 תמונות בקצב המהיר ביותר. פעל עם הקלטה של ​​רצף שלאחר אקונומיקה איטי של ~ 50 תמונות, בחירת עיכוב בין תמונות כמו 1-20 s, תלוי בקצב הדיפוזיה של החלבון. שלב את העוצמה בפנים במקום אקונומיקה במסגרות כל ולתקן אותה הלבנה ואור תנודות בעוצמה במהלך הרכישה על ידי חלוקת העוצמה בתוך המקום מולבן מעוצמת ממוצע של נקודה התייחסות מחוץ לאזור לייזר מולבן. נרמל את עוצמת לתקן כדי להפוך את עוצמת מראש מולבן שווה 1 ואת עוצמת מולבן הראשונית שווה 0. התאם את העיקול של עוצמת זמן מנורמל לעומת, F (t), באמצעות המשוואה הבאה: 5 F (t) = M x exp (-2T / t) x (אני 0 (2T / t) + אני 1 (2T / t)), (Eq.1) שם M היא חלק ניידים של מולקולות לשדר, T הוא הזמן דיפוזיה אופייני, לא זה הזמן האמיתי של כל מסגרת מוקלט, אני 0 ואני 1 הם ה 0 ו 1 כדי רחוב שונה פונקציות בסל. חשב את מקדם הדיפוזיה, D, כמו: D = R 2 / 4T, (Eq.2) כאשר R הוא רדיוס במקום מולבן. העבר לאo היטב הבא וחזור על שלבים 2.5) – 2.13). השוואת שברים ניידים מקדמי דיפוזיה שהושגו על תנאי ההקרנה שונים. התגבשות עיצוב חדש המסכים המבוססים על רכיבים שאפשרו דיפוזיה חלבון ותנאי למעט עבורו דיפוזיה חלבון לא נצפתה. אם החלבון לא מפוזר בכל התנאים הוקרנו, שקול להרחיב את שטח הקרנה או מנסה חלבון חדש לבנות. 3. הגדרת ניסויים התגבשות LCP החלבון מחדש ב LCP כמתואר בסעיף 1). מעבירים את LCP חלבון עמוס לתוך מזרק 10 גז חזק μL מצורף מזרק מנפק חוזרות. צרף מחט נשלף קצר (מד 26, 10 מ"מ אורך) כדי המזרק μL 10. לוותר על 200 פיתיונות מיובשים NL של LCP על פני השטח של ארבע בארות סמוכות ויוצרים ריבוע 2×2. כיסוי כל אחד פיתיונות מיובשים LCP עם μL 1 של התגבשות הפתרון המתאים למסך. שווי ארבע בארות עמוסה coverslip זכוכית 18 מ"מ מרובע. החלת לחץ עדין על coverslip לאטום את הבארות. חזור על שלבים 3.4) -3.6) עם סט הבא של 4 הבארות עד צלחת כולו מלא. דגירה את הצלחת בטמפרטורה קבועה, מעת לעת בדיקה ליצירת צמיחה קריסטל. 4. מסיק מן קריסטלים LCP מניחים צלחת עם גבישי חלבון תחת מיקרוסקופ סטריאופוני עם זום משתנה, מצויד מקטב מנתח מסתובב ליניארי. התמקד גם ריבית באמצעות זום צריכת חשמל נמוכה, כך גם כל מושם בתוך שדה הראייה. ציון הזכוכית coverslip בתוך ארבע משיכות עושה ריבוע בתוך גבולות גם באמצעות אבן הפינה החדה של חיתוך קרמיקה נימי. לחץ מסביב הבקיע עם פינצטה חדה נקודה חזקה כדי להפיץ את שריטות באמצעות עובי הזכוכית coverslip. פאנץ שני חורים קטנים בפינות מול הכיכר הבקיע. הזרק μL כמה פתרון נמהר דרך אחד החורים להפחית התייבשות במהלך השלבים הבאים. באמצעות בדיקה זווית מחט חדה לשבור את הכוס לאורך אחד או שני הצדדים לשחרר את הכיכר לחתוך החוצה. הרם בזהירות את צופה מרובע זכוכית בולוס השלב מעוקב. אם בולוס הוא דבק coverslip, ואז להפוך את הכיכר זכוכית מעל ומניחים על תחתית הבאר. הוסף μL מספר נוסף של פתרון נמהר, בתוספת cryo-מגנים, במידת הצורך, על גבי בולוס חשפו את השלב מעוקב בבאר. הגדל את ההגדלה של המיקרוסקופ ולהתמקד גביש. התאם את הזווית בין מקטב לבין מנתח להגדיל את הניגוד בין הגביש birefringent ואת הרקע, תוך שמירה על מספיק אור כדי לראות את הלולאה קציר. בחר MicroMount MiTeGen בקוטר התאמת גודל קריסטל ואז מסיק קריסטל ישירות LCP על ידי וגרף אותו לתוך MicroMount. פלאש להקפיא את MicroMount עם הגביש שנקטפו בחנקן נוזלי, ולשלוח אותו beamline מקור synchrotron עבור רנטגן איסוף הנתונים 6. 5. נציג תוצאות: בטא מהונדסים אדם 2 adrenergic G-חלבון קולטן מצמידים (β 2 AR-T4L) באה לידי ביטוי baculovirus sf9 נגועים בתאי חרקים מטוהרים ב dodecylmaltoside (DDM) / cholesteryl hemisuccinate (CHS) פתרון אבקת חייב אגוניסט הפוך חלקי carazolol 7. חלבון היה תווית עם אסתר NHS Cy3 בשימוש LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני (איור 2). מסכי רשת גס מבוסס על כמה תנאים שנבחרו מתוצאות LCP-FRAP מבחני הפיק הראשוני קריסטל דמוי להיטים (איור 3). אופטימיזציה נוספת של התנאים נמהר הניבו איכות עקיפה גבישים (איור 4). באיור 1. תרשים זרימה של ניסוי LCP טיפוסי התגבשות. צעדים בתיבות אפור לא מתוארים בפרוטוקולים הנוכחי. 2. איור LCP-FRAP assay עם AR-T4L/carazolol 2 β ב LCP monoolein מבוסס. א) תוצאות של assay LCP-FRAP ביצע במצב תפוקה גבוהה אוטומטית, שבה כל דגימה של צלחת 96-גם הוא מחומצן ברצף והתאוששות הקרינה נמדדת לאחר דגירה 30 דקות. החלמה הקרינה שהתקבלו, המייצגים את השבר הנייד מדגם זה, הם זממו במשך כל 96 דגימות. פתרונות סינון מכילים 0.1 M טריס pH 8, 30% v / v PEG 400 בשילוב עם 48 מלחים שונים בשני ריכוזים שונים. ב) התאוששות פרופילים Fluorescence עבור נציג מספרresentative תנאים. עקומות קו מוצק מייצגים מתאים על ידי Eq. שברים ניידים 1.The ואת מקדמי דיפוזיה נקבעים באמצעות Eqs. 1 ו -2. התאוששות מהירה של פחות מ -10% במדגם המכיל כלוריד Na נובע שומנים שכותרתו fluorescently שיתוף מטוהרים עם החלבון. איור 3. להיטים קריסטל ראשוניות של AR-T4L/carazolol 2 β מתקבל על ידי מיון רשת גס סביב התנאים המבטיחים ביותר שזוהה על ידי LCP-FRAP, המכיל סולפט Na (פאנל) ו Na Formate (לוח ב '). חלבון הוא תווית עם אסתר NHS Cy3 ותמונות פלורסנט נלקחים באמצעות עירור ב 543 ננומטר פליטה ב 605 ננומטר. איור 4. גבישים אופטימליים של AR-T4L/carazolol 2 β. התמונות של גבישים גדל בנוכחות סולפט Na (לוחות A ו-B) ו-K Formate (פאנלים C ו-D) נלקח במצב brightfield (לוחות A ו-C) ושימוש צולבות מקטבים (לוחות B ו-D).