פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה
Summary
הפיתוח של מבחני אישית על פלטפורמה VIBE עבור רגישים יותר, תוצאות לשעתקו אוטומטיות מטריצות מורכבות מתואר. מחסנית האוניברסלי מאפשר מבחני להיות מותאם בקלות לשימוש עם מבחני אישית. גמישות זו מאפשרת אימות פיתוח מהיר של מבחני רומן או בגרסאות אוטומטיות של מבחני ידנית הקיימת, מדגים בסרטון הזה.
Abstract
מבחני התאמה אישית של חלבונים ייחודיים מוגבלים לעיתים קרובות בזיהוי זמן רב ידני וטכניקות quantitation כגון ELISA או כתמים המערבי בשל המורכבות של פיתוח על גבי פלטפורמות חלופיות. ממברנה אקוסטית הקניינית של BioScale microparticle (AMMP) הטכנולוגיה מאפשרת immunoassays כריך להתפתח בקלות לשימוש בפלטפורמת VIBE, מתן רגישות יותר, שחזור, והפעלה אוטומטית. בתנאי כדוגמה, פרוטוקול זה מתאר את הליך לפיתוח אוגר מנהג סינית השחלות-Cell Host חלבון (CHO-HCP) assay. העקרונות הכלליים שהותוו כאן ניתן בעקבות לפיתוח מגוון רחב של immunoassays.
Assay מודד AMMP אנטיגן ריכוז ידי מדידת השינויים בתדירות תנודה הנגרמת על ידי קשירה של microparticles אל פני השטח את חיישן לחשב. היא מורכבת מארבעה מרכיבים עיקריים: (1) מחסנית המכילה שבב פונקציונליות eight חיישן (2) שכותרתו נוגדן microparticles מגנטי, (3) נוגדנים hapten מתויג שקושר אל פני השטח של שבב פונקציונליות (4) דגימות המכיל את האנטיגן של עניין. Biosensor של BioScale הוא מכשיר התהודה זה מכיל שמונה ממברנות הפרט עם fluidic נתיבים נפרדים. ממברנות שינוי תדר תנודה בתגובה צבירת מסה על פני השטח, וזה שינוי תדר משמש לכמת את כמות המסה הוסיף.
כדי להקל על השימוש במגוון רחב של immunoassays החיישן פונקציונליות עם נוגדן אנטי hapten. נוגדנים ספציפיים Assay משתנים דרך נטיה קוולנטיים של תג hapten על נוגדן אחד ביוטין השני. התווית ביוטין משמש כדי לאגד את הנוגדן streptavidin בשילוב חרוזים מגנטיים, אשר בשילוב עם נוגדנים hapten-מתויג, משמשים כדי ללכוד את אנליטי בתוך כריך. הקומפלקס נקשר השבב דרך האינטראקציה anti-hapten/hapten. בסוף כל assay להפעיל את החיישנים מנקים עם חומצה לדלל המאפשר ניתוח רציף של עמודים מתוך צלחת 96-היטב.
כאן, אנו מציגים את השיטה לפיתוח assay אישית CHO-HCP AMMP לפיתוח Bioprocess. פיתוח מבחני AMMP או שינוי מבחני הקיימים מבחני AMMP יכול לספק ביצועים טובים יותר (, רגישות reproducibility) בדגימות מורכבות הזמן מפעיל מופחת. פרוטוקול מראה את הצעדים לפיתוח בסעיף דיון ביקורות תוצאות נציג. לקבלת הסבר מעמיק יותר של אופטימיזציה assay ופרמטרים התאמה אישית מגע BioScale. ערכה זו מציעה הגנרית מבחני Bioprocess פיתוח כגון חלבון שיורית titer, מוצר, ואת CHO-HCP.
Protocol
Discussion
הדוגמאות לעיל להפגין רגישות גבוהה של AMMP תוצאות כמותיות בדגימות מורכבות. זה ביצועים, כאשר נמסר בקלות ובקרה של עיצוב ריאגנטים לתוך המערכת מאפשרת עבור מגוון של יישומים. יישומים אלה עשויים להיות מטרה ספציפית, כמו Gadd34 בגידול, או גנרי למגוון מטרות, כמו זיהוי התא המארח quantitation חלבון בדגימות כי לחצות את הנחל טיהור. תקורה נמוכה VIBE פלטפורמה בשילוב עם AMMP גמישה מספק כלי רב עוצמה להעברת מבחני קריטי.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit | ||||
| If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required | ||||
| Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | ||||
| Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9) | ||||
| Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | ||||
| Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations | ||||
| Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab) | ||||
| Streptavidin magnetic beads | BioScale | (10 mg/mL) ~108 beads/mg | ||
| Magnet for microcentrifuge tubes | New England BioLabs | cat # S1510S | ||
| Biotinylated BSA for blocking | ||||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||||
| PBS 0.1% Tween 20 | ||||
| Vortex | ||||
| Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator | ||||
| Antibody or protein to be labeled | ||||
| NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit | ||||
| If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required | ||||
| Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | ||||
| 50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9) | ||||
| Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | ||||
| Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm. | ||||
| Diluent | BioScale | to dilute beads and FlAb | ||
| Sample Diluent | BioScale | to dilute samples and calibrators | ||
| Running Buffer Additive | BioScale |
