Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

1. Tessuto Collezione: Utilizzare topi tra 7 e 12 settimane di età. Di solito, almeno due animali sono utilizzati: uno è quello di impostare il FACS monocolore controlli necessari per il risarcimento e per campioni isotipo fluorescenza-meno-un controllo. L'altro è il campione reale per l'ordinamento. Euthanize i topi da CO 2 inalazione o secondo un protocollo di etica della scelta. Topi posto su un tovagliolo di carta, rivolta verso l'alto, e spruzzare con il 70% di etanolo a fondo per evitare la contaminazione con la pelliccia del mouse. Sollevare la cute nella regione addominale con una pinza, poi fare un piccolo taglio longitudinale con forbici affilate. Sbucciate i due lembi di pelle in direzioni opposte (su e giù) per esporre completamente i muscoli degli arti posteriori sotto. Dell'accisa il tessuto muscolare inserendo ed estendendo le forbici lungo entrambi i lati della tibia. Ripetere la stessa procedura per il femore per estrarre il tessuto muscolare. Mettere tutti i tessuti muscolari asportati in 60 millimetri di Petri-piatti, utilizzando un piatto per il tessuto di ogni topo. Ripetere quanto sopra per tutti i mouse. 2. Dissociare tessuto in cellule singole per digestione enzimatica: In questa sezione del protocollo, utilizzare i reagenti e strumenti sterili e lavorare in condizioni sterili. Aggiungere 2 ml di Collagenasi II (Sigma, cat # 6885, 500U / mL) e 20 l di 250mm CaCl 2 magazzino ad ogni Petri-piatto. Lacerare il tessuto muscolare in piccoli pezzi (circa 1 mm 3) con due pinze (una seghettato, una con 2 denti, da Strumenti Scienze Arti, cat # 11051-10, 11154-10), facendo attenzione a rimuovere ed eliminare il più contaminati non-tessuto muscolare possibile. Coprire il Petri-piatti e incubare loro a 37 gradi centigradi per 30 minuti. Recuperare il Petri-piatti e usare una siringa da 3 ml stantuffo a schiacciare a fondo i pezzi di tessuto. Utilizzare uno stantuffo per ogni campione per evitare contaminazioni. Aggiungete un po '(~ 5 ml) PBS freddo sterile ad ogni Petri-piatto e trasferire i fanghi tessuto in un tubo 50mL Falcon (sciacquare la Petri-piatto, se necessario, di recuperare tutti i tessuti) Agitare la provetta Falcon vigorosamente, riempire la provetta con PBS, centrifugare @ 800 giri x 5 minuti (da banco Eppendorf top Modello: 5810R), e aspirare il surnatante (ripetere 3 volte) Aggiungere 1 ml di miscela Collagenasi D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / mL) / dispasi II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / mL) e 10μL di CaCl 2 (250mm) a ciascuna provetta, incubare a 37 gradi Celsius con rotazione per un'ora. Aggiungere 5-10 ml di freddo, sterile PBS, vortice e pipetta accuratamente per omogeneizzare il tessuto. Riempire i tubi con PBS e mescolare bene. Trasferire il liquido in un colino cellula 40μm collocato su un tubo 50 ml Falcon per filtrare i pezzi di altri grandi produttori di tessuto. Dividere ogni campione uniformemente in tre 50mL tubi Falcon. Riempire ciascuno dei tubi con PBS quindi si centrifuga @ 1600rpm per 5 minuti a 8 gradi Celsius. Eliminare il supernatante e raccogliere le cellule per la colorazione. 3. Anticorpi colorazione e ordinamento: In questa sezione del protocollo, l'uso FACS tamponi sterili e la raccolta e il lavoro in condizioni sterili. Anticorpi commerciali sono generalmente considerati sterili se correttamente gestita. Per singolo colore e campioni di controllo isotipico, risospendere il campione in 1 ml di buffer FACS e dividere le cellule sospese in nove 1,5 ml di pre-etichettati tubi Eppendorf (100 l ogni tubo). Impostare colorazione singolo colore si mescola in base alla seguente tabella: ATTENZIONE: La concentrazione finale di anticorpi isotipo di controllo nella macchia dovrebbe corrispondere a quello dell'anticorpo primario sono il controllo. Per esempio, se anti-Sca-1 è usato per 1 μg/10 6 celle, il suo isotipo corrispondente deve essere utilizzato alla stessa concentrazione. Tubo # Nome del tubo Azienda Cat # clone isotipo diluizione 1 Non macchia 2 Hoechst33342 sigma B2261 2-5ug/ml 3 PI sigma P4864 1ug/ml 4 CD31-FITC CD45-FITC eBioscience 11-0311-85 390 Rat IgG2a 500 Fatti in casa I3 / 2 Rat IgG2b 500 5 SCA1-PECY7 eBioscience 25-5981-82 D7 Rat IgG2a 5000 6 α-7 APC Fatti in casa R2F2 Rat IgG2b 1000 Impostare colorazione controllo isotipico mescola con la seguente tabella: Tubo # Nome di tubo Hoechst PI CD31- FITC CD45- FITC Scal- PE-Cy7 A-7- APC Rat- IgG2b- APC Rat- IgG2a- pecy7 Rat- IgG2a- FITC Rat- IgG2b- FITC 7 Iso- CD31 / CD45 + + – – + + – – + + 8 Iso- Scal- pecy7 + + + + – + – + – – 9 Iso- α-7-APC + + + + + – + – – – Pipettare il singolo colore e di isotopi mescola colorazione di controllo (di solito regolare la concentrazione di anticorpi in modo che tra 5 e 10 ml di colorazione miscela vengono aggiunti ad ogni campione) nel tubo Eppendorf appropriato dal punto 20. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 1 ora. Macchia cellule di topo campione con 800μL del cocktail di anticorpi (in basso) per l'ordinamento delle cellule FACS. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 1 ora. Anticorpi cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC ATTENZIONE: Il rapporto ottimale di anticorpi contro le cellule devono essere determinata individualmente ogni titolazione degli anticorpi, in quanto possono esistere differenze significative tra i lotti. La quantità ottimale di anticorpi da utilizzare devono essere espressi in μgs di anticorpi per 10 6 cellule bersaglio e mantenuta costante durante l'utilizzo dello stesso lotto di anticorpi. Chiaramente, se il numero di cellule bersaglio non cambia significativamente tra gli esperimenti, o se il volume colorazione è in scala con il numero di cellule, una diluizione fisso di ciascun anticorpo può essere utilizzato anche. Lavaggio: Aggiungere circa 1 ml di buffer di FACS per ognuna delle 9 provette di controllo, aggiungere circa 20 mL di tampone FACS alla provetta. Centrifugare le provette Eppendorf @ 3000rpm per 5 minuti (da banco centrifuga Eppendorf in alto, Modello: 5417C). Centrifugare la provetta @ 1600rpm per 5 minuti (da banco centrifuga Eppendorf in alto, Modello: 5810R). Aspirare e scartare il supernatante da tutti i tubi. Risospendere le cellule nel buffer FACS (1 ml per ciascuno dei controlli, da 4 ml per il campione ordinamento), le cellule Pipettare in "tubi FACS" attraverso il filtro delle cellule tappo (cat BD Falcon # 352235, 40μm dimensioni dei pori) per rimuovere macchie rimanenti che possono influire sul citometro. Impostare il FACS sorter con controlli singolo colore e controlli isotipo. Raccogliere le cellule ordinati secondo la tabella seguente in un buffer di 3,5 ml di raccolta (95% DMEM, 5% FBS) separatamente. Normalmente, quando la raccolta entrambi gli arti posteriori, un mouse di tipo selvatico potrebbe produrre circa 150.000 cellule progenitrici miogeniche o 100.000 cellule progenitrici adipogenico, con la vitalità superiore al 95%, come giudicato da rianalizzati cellule ordinati per FACS al termine della procedura (Figura 1 ) Definizione dei progenitori miogenici e adipogenico base alla colorazione della superficie Anticorpo / macchia Progenitrici miogenici (MP) Progenitrici adipogenico (AP) Hoechst + + PI – – CD31-FITC – – CD45-FITC <td> – – SCA1-PECY7 – + α-7 APC + – 4. Trapianto: Centrifugare le cellule ordinati @ 1500rpm per 5 minuti, togliere le cellule surnatante e trasferimento in autoclave i tubi Eppendorf (1,5 ml), lavare le cellule con 500 l di PBS sterile (i livelli di free!), Quindi si centrifuga @ 3000rpm per 5 minuti. Il mantenimento di tutti i reagenti in condizioni sterili e lavorare in un cappuccio colture di tessuti, risospendere progenitori miogenici in PBS, o progenitrici adipogenico in Matrigel (BD cat # 354234) a circa 10 6 cellule / ml. Trapianto di progenitori miogenici o progenitrici adipogenico ai topi destinatario. Anestetizzare il mouse con isoflouran secondo la vostra politica istituzione. Radersi i capelli intorno alla regione di iniezione, poi sterilizzare la pelle strofinando con etanolo al 70% Iniettare 20μL dei progenitori miogenici o progenitori adipogenico (= 20k cellule) con un 3 / 10 siringa da insulina CC (cat BD # 309300). Dopo un tempo adeguato (tre settimane funziona bene, ma miofibre transgenici che esprimono i marcatori del donatore-derivati ​​sono di solito evidenti entro una settimana dopo il trapianto), anestetizzare i topi destinatario da passaggio 29 mediante iniezione intraperitoneale di 400 microlitri Avertin (Cat Sigma # T04840-2, 25 mg / ml), poi profumato transcardially con 50mL PBS (contiene 10 mM di EDTA) per primo, seguito da 15 ml del 4% PFA. Raccogliere tessuto bersaglio, post-fix con 4% PFA durante la notte, se necessario, poi il trasferimento al 20% di saccarosio durante la notte. Incorpora in ottobre, congelare e cryosection. 5. Rappresentante dei risultati: MP quando vengono trapiantate nel muscolo scheletrico del mouse, che prontamente si fondono con pre-esistente miofibre. Pertanto, qualsiasi etichetta genetico presente nelle cellule del donatore sarà facilmente individuabile nelle fibre che li ha accolti. La figura 2 mostra un esempio in cui le cellule trapiantate espresso umane phostphatase alcalino, ha rivelato istochimicamente. AP quando vengono trapiantate il risultato dipende in larga misura l'ambiente del sito trapianto: quando queste cellule trapiantate per via sottocutanea dare origini a adipociti e miofibroblasti (vedi figura 2). In molti altri siti, compresi i muscoli, non sopravvivono a meno degenerazione grassa è stata indotta 3. Figura 1. Ordinamento strategia per l'isolamento delle popolazioni progenitrici dal muscolo scheletrico (A) strategia Ordinamento:. Cellule vitali sono state identificate sulla base di dispersione in avanti e side scatter. Colorazione Hoechst è stato utilizzato per escludere detriti anuclear e ioduro di propidio (PI) colorazione di escludere le cellule morte. Ematopoietiche (CD45) ed endoteliali (CD31), le cellule sono state escluse dalle porte di smistamento. Il α7 + Hoechst + PI – CD45 – CD31 – Scal – sottoinsieme contiene tutti i progenitori miogenici (MP). Il Scal + Hoechst + PI – CD45 – CD31 – α7 – popolazione contiene progenitori adipogenico (AP). (B) Fluorescenza-minus-one (FMO) controlla isotipo confermare la specificità della macchia. (C) Purezza controlli di sottoinsiemi MP e AP dopo l'ordinamento. Figura 2. Risultati rappresentativi seguenti MP e AP di trapianto. AP sono stati trapiantati per via sottocutanea (pannello superiore) e MP per via intramuscolare (pannello inferiore). In entrambi i casi, le cellule del donatore origine da un topo transgenico che esprime fosfatasi alcalina umano, identificato dalla colorazione marrone.