1. Tissue Collection: Verwenden Mäusen zwischen 7 und 12 Wochen alt. In der Regel werden mindestens zwei Tiere verwendet: Die eine ist die Einrichtung der FACS einfarbige Kontrollen für Entschädigung und für die Fluoreszenz-minus-eins Isotypkontrolle Proben erforderlich. Die andere ist die eigentliche Probe für die Sortierung. Euthanize die Mäuse durch CO 2-Inhalation oder nach einer Ethik-Protokoll der Wahl. Legen Mäuse auf einem Papiertuch, nach oben und Spray mit 70% Ethanol gründlich, um eine Kontamination mit der Maus Fell zu verhindern. Heben Sie die Haut in der Bauchregion mit einer Pinzette, dann machen Sie einen kleinen Längsschnitt mit einer scharfen Schere. Peel die beiden Hautlappen in entgegengesetzte Richtungen (oben und unten) vollständig aussetzen Hinterbein darunter liegenden Muskeln. Excise das Muskelgewebe durch das Einfügen und Erweiterung der Schere an beiden Seiten der Tibia. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Oberschenkelknochen, um das Muskelgewebe zu extrahieren. Legen Sie alle herausgeschnitten Muskelgewebe in 60mm Petrischalen, mit einer Schale für das Gewebe von jeder Maus. Wiederholen Sie die oben für alle Mäuse. 2. Distanzieren Tissue in einzelne Zellen durch enzymatische Verdauung: In diesem Abschnitt des Protokolls, verwenden Sie sterile Reagenzien und Instrumente und Arbeiten unter sterilen Bedingungen. Geben Sie 2 ml Collagenase II (Sigma, Kat. Nr. 6885, 500U / ml) und 20 ul von 250mm CaCl 2 Lager zu jedem Petri-Schale. Reißen Sie das Muskelgewebe in kleine Stücke (ca. 1 mm 3) mit zwei Pinzetten (eine gezackte, eins mit 2 Zähnen, von Fine Science Tools, cat # 11051-10, 11154-10), aufmerksam zu entfernen und zu entsorgen, wie viel kontaminiertes Nicht-Muskelgewebe wie möglich. Decken Sie die Petrischalen und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Rufen Sie die Petri-Schalen und ein 3-ml-Spritze Kolben gründlich Maische die Gewebestücke. Verwenden Sie einen Stempel für jede Probe, um Kontaminationen zu vermeiden. Fügen Sie einige (~ 5 ml) sterilen kalten PBS zu jeder Petrischale und Transfer des Gewebes Schlamm in einen 50 mL Falcon-Röhrchen (spülen Sie die Petri-Schale bei Bedarf alle Gewebe zu erholen) Shake the Falcon Röhrchen kräftig, füllen Sie das Röhrchen mit PBS, Zentrifuge @ 800rpm x 5 Minuten (Eppendorf Tischgerät Modell: 5810R), und saugen Sie den Überstand (3 Mal wiederholen) 1ml Mischung von Collagenase D (Roche, Kat. Nr. 11088882001, 1,5 HE / ml) / Dispase II (Roche, Kat. Nr.: 04942078001, 2.4u / ml) und 10 &mgr; l von CaCl 2 (250mm) in jedes Röhrchen, bei 37 Grad Celsius mit Rotation für eine Stunde. Fügen Sie 5-10 ml kalte, sterile PBS, Wirbel und Pipette gründlich, um das Gewebe zu homogenisieren. Füllen Sie Rohre mit PBS und gut mischen. Übertragen Sie die Flüssigkeit in einen 40 um Zellsieb auf einem 50 mL Falcon-Röhrchen platziert, um herauszufiltern, die übrigen große Stücke von Gewebe. Teilen Sie jede Probe gleichmäßig in drei 50 mL Falcon-Röhrchen. Füllen Sie jedes der Röhrchen mit PBS zentrifugieren @ 1600rpm für 5 Minuten bei 8 Grad Celsius. Überstand verwerfen und sammeln Zellen für die Färbung. 3. Antikörper-Färbung und Sortierung: In diesem Abschnitt des Protokolls, mit sterilen FACS und Sammlung Puffer und Arbeit unter sterilen Bedingungen. Kommerzielle Antikörper sind in der Regel als steril, wenn sie richtig gehandhabt. Für einzelne Farb-und Isotyp-Kontroll-Proben, resuspendieren der Probe in 1 ml FACS-Puffer und teilen die suspendierten Zellen in neun 1,5 ml pre-markierten Eppendorf-Röhrchen (100 ul pro Röhre). Richten Sie einfarbige Färbung mischt nach der folgenden Tabelle: ACHTUNG: Die endgültige Konzentration von Isotyp-Kontroll-Antikörper in der Fleck sollte, dass der primäre Antikörper sind sie die Kontrolle für übereinstimmen. Zum Beispiel, wenn anti-Sca-1 für 1 μg/10 6 Zellen verwendet wird, muss der entsprechende Isotyp in der gleichen Konzentration eingesetzt werden. Tube # Name der Röhre Firma Cat # Klon Isotyp Verdünnung 1 Non-Fleck 2 Hoechst33342 sigma B2261 2-5ug/ml 3 PI sigma P4864 1ug/ml 4 CD31-FITC CD45-FITC eBioscience 11-0311-85 390 Rat IgG2a 500 Haus gemacht I3 / 2 Rat IgG2b 500 5 SCA1-PECY7 eBioscience 25-5981-82 D7 Rat IgG2a 5000 6 α-7 APC Haus gemacht R2F2 Rat IgG2b 1000 Set up Isotypkontrolle Färbung mischt anhand der folgenden Tabelle: Tube # Name von Rohr Hoechst PI CD31- FITC CD45- FITC Sca- PE-CY7 A-7- APC Rat- IgG2b- APC Rat- IgG2a- pecy7 Rat- IgG2a- FITC Rat- IgG2b- FITC 7 Iso- CD31 / CD45 + + – – + + – – + + 8 Iso- Sca- pecy7 + + + + – + – + – – 9 Iso- α-7-APC + + + + + – + – – – Pipettieren der einzelnen Farb-und Isotopen-Kontrollfärbung mischt (wir normalerweise passen Sie die Konzentration von Antikörpern, so dass zwischen 5 und 10 l Färbung Mix zu jeder Probe hinzugefügt werden) in die entsprechenden Eppendorf-Röhrchen aus Schritt 20. Gut mischen und auf Eis inkubieren für 1 Stunde. Stain Zellen von Probe-Maus mit 800μL der Antikörper-Cocktail (unten) für FACS cell sorting. Gut mischen und auf Eis inkubieren für 1 Stunde. Antikörper-Cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC ACHTUNG: Das optimale Verhältnis von Antikörpern gegen Zellen müssen durch individuelle Titration jeder Antikörper, da erhebliche Unterschiede zwischen den Chargen gibt bestimmt werden kann. Die optimale Menge an Antikörper verwendet werden sollte in μgs Antikörper pro 10 6 Target-Zellen exprimiert und konstant gehalten werden, wenn mit der gleichen Charge des Antikörpers. Klar, wenn die Zahl der Zielzellen nicht signifikant ändert zwischen den Experimenten, oder wenn die Färbung Band mit der Anzahl der Zellen skaliert wird, eine feste Verdünnung von jeder Antikörper können ebenfalls verwendet werden. Wash: In ca. 1 ml FACS-Puffer zu jedem der 9 Röhren, fügen Sie etwa 20 mL FACS-Puffer, um das Probenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Eppendorf-Röhrchen @ 3000rpm für 5 Minuten (Eppendorf Tischzentrifuge, Modell: 5417C). Centrifuge das Probenröhrchen @ 1600rpm für 5 Minuten (Eppendorf Tischzentrifuge, Modell: 5810R). Absaugen und den Überstand verwerfen aus allen Rohren. Die Zellen in der FACS-Puffer (1 ml für jede der Steuerungen, 4ml für die Sortierung Probe), um Pipette Zellen in "FACS-Röhrchen" durch die Zelle Sieb Kappe (BD Falcon cat # 352235, 40 um Porengröße) zu entfernen restlichen Klumpen, kann Einfluss auf die Durchflusszytometer. Richten Sie die FACS-Sorter mit einfarbigem Kontrollen und Isotypkontrollen. Sammeln sortierten Zellen nach der folgenden Tabelle in einer 3,5-ml-Collection-Puffer (95% DMEM, 5% FBS) getrennt. Normalerweise, wenn die Ernte beide Hinterbeine, könnte ein einzelner Wildtyp-Maus ungefähr 150.000 myogenen Vorläuferzellen oder 100.000 adipogenen Vorläuferzellen, die Lebensfähigkeit von über 95%, wie von reanalyzing sortierten Zellen durch FACS gemessen am Ende des Verfahrens (Abbildung 1 Ertrag ) Definition von myogenen und adipogenen Vorfahren auf Oberflächenbeschmutzung Basis Antikörper / Fleck Myogenen Vorläuferzellen (MP) Adipogene Vorläuferzellen (AP) Hoechst + + PI – – CD31-FITC – – CD45-FITC <td> – – SCA1-PECY7 – + α-7 APC + – 4. Transplantation: Centrifuge sortierten Zellen @ 1500rpm für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand und Transfer Zellen autoklaviert Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml), spülen Zellen mit 500 ul sterilem PBS (Serum-freien!), Dann Zentrifuge @ 3000rpm für 5 Minuten. Unter Beibehaltung aller Reagenzien unter sterilen Bedingungen und Arbeiten in einer Gewebekultur Kapuze, resuspendieren myogenen Vorläuferzellen in PBS oder adipogenen Vorläuferzellen in Matrigel (BD cat # 354234) bei ca. 10 6 Zellen / ml. Transplant myogenen Vorläuferzellen oder adipogenen Vorläuferzellen zu Empfängermäuse. Betäuben die Maus mit isoflouran nach Ihrer Institution Politik. Shave das Haar um die Injektion Region, dann sterilisieren der Haut durch Reiben mit 70% Ethanol Inject 20 &mgr; l von myogenen Vorläuferzellen oder adipogenen Vorläuferzellen (= 20k-Zellen) mit einem 3 / 10 CC Insulinspritze (BD cat # 309300). Nach einer angemessenen Zeit (3 Wochen funktioniert gut, aber Muskelfasern Ausdruck Spender stammenden transgenen Marker sind in der Regel innerhalb einer Woche nach der Transplantation deutlich), betäuben den Empfänger Mäuse aus Schritt 29 durch intraperitoneale Injektion von 400 ul Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 mg / mL), dann transkardial perfuse mit 50 ml PBS (enthält 10 uM EDTA) zuerst, gefolgt von 15 ml 4% PFA gefolgt. Sammeln Zielgewebe, post-fix mit 4% PFA über Nacht, wenn erforderlich, dann Transfer bis 20% Saccharose über Nacht. Embed in OCT, Gefrier-und Gefrier. 5. Repräsentative Ergebnisse: Wenn MP in Maus-Skelettmuskel transplantiert werden, sie leicht mit bereits vorhandenen Muskelfasern verschmelzen. Daher ist jede genetische Label in der Spenderzellen wird leicht erkennbar in den Fasern, die sie erhalten haben. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel, wo die transplantierten Zellen exprimierten humanen alkalischen phostphatase zeigte histochemisch. Wenn AP transplantiert sind das Ergebnis hängt stark von der Umgebung der Transplantation Ort: bei transplantierten subkutan diese Zellen Herkunft geben Adipozyten und Myofibroblasten (siehe Abbildung 2). In vielen anderen Standorten, einschließlich Muskeln, sie nicht überleben, wenn Verfettung hat 3 induziert worden. Abbildung 1. Sorting-Strategie zur Isolierung von Vorläuferzellen Populationen aus Muskelfleisch (A) Sorting Strategie:. Lebende Zellen wurden auf der Grundlage Vorwärtsstreuung und side scatter identifiziert. Hoechst-Färbung wurde verwendet, um kernlosen Schutt und Propidiumiodid (PI)-Färbung auszuschließen, um tote Zellen auszuschließen. Hämatopoetischen (CD45) und Endothelzellen (CD31)-Zellen wurden aus der Sortierweichen ausgeschlossen. Die α7 + Hoechst + PI – CD45 – CD31 – Scal – Teilmenge enthält alle myogenen Vorläuferzellen (MP). Die Scal + Hoechst + PI – CD45 – CD31 – α7 – Bevölkerung enthält adipogenen Vorläuferzellen (AP). (B) Fluoreszenz-minus-eins (FMO) Isotypkontrollen bestätigen die Spezifität der Färbung. (C) Reinheit überprüft der MP-und AP-Teilmengen nach dem Sortieren. Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse nach MP-und AP-Transplantation. AP wurden subkutan (oberes Feld) transplantiert und MP intramuskulär (unten). In beiden Fällen entstand Spenderzellen aus einer Maus zum Ausdruck transgene menschliche alkalische Phosphatase, durch die braune Färbung identifiziert.
