사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향
Summary
24hpf에서 zebrafish otocyst에 직접 morpholinos를 전달하는 방법이 개발되었습니다. 귀의 소포 및 침투력을 효과 electroporation의 루멘에 morpholinos의 microinjection을 사용하여, 우리는 두뇌에 morpholinos의 효과를 무시하고 내이 (内耳)에 특정 효과를 얻을 수 있었다.
Abstract
최근에는 electroporation은 눈, 뇌 및 zebrafish의 somites 등 다양한 조직로 DNA, RNA, 그리고 morpholinos의 생체내 transfection에 대한 인기가 기술되고있다. 유전자 조작의 다른 방법 이상의 electroporation의 장점은 특정 조직은 전류의 응용 프로그램에 의해 macromolecules의 도입을 위해, 두 공간과 temporally, 타겟이 될 수있다는 것입니다. 여기서 우리는 zebrafish의 개발 내이 (内耳)의 조직에 MIF 및 MIF 같은 morpholinos를 transfecting위한 electroporation의 사용을 설명합니다. 과거 연구에서는 MIF morpholino은 1 배아에 주입 – 8 세포 단계에 확산 형태학의 신경계 및 안구의 변화뿐만 아니라 귀에 결과. 개발 나중 단계에서 내이 (内耳)의 조직을 대상으로하여, 우리는 다른 조직의 영향에서 발생할 수 있습니다 보조 효과를 반대로 개발 내이 (内耳)에서 MIF의 주요 효과를 확인할 수 있습니다. 뉴런,의 연결을 처리하고, 사후 망막의 황반과 관련된 세포의 형태를 연구 얼룩 phalloidin 및 acetylated tubulin을 사용함으로써, 우리는 zebrafish 내이 (内耳)에서 타겟으로 transfection을위한 방법으로 electroporation의 효능을 평가할 수 있었다. 24hpf 배아의 귀의 vesicles는 morpholinos와 electroporated로 주입되었고 그 어떤 치료를받은 적이 없음 또는 유일한 주입 또는 electroporated 있었다 배아에 비해했다. 주입 및 electroporated했다 공룡의 태아가 머리 셀 번호의 감소를 보여주 statoacoustic 신경절 (SAG)과 통제 그룹에 비해 적은 세그 뉴런에 의해 innervation을 감소. 결과는 나중 단계에서 otocysts에 morpholinos의 직접 배달은 불특정 신경계와 1-8 세포 단계에서 제공 morpholinos의 신경 크레스트 효과를 피할 것으로 나타났다. 또한 허용하는 내이 (内耳)와 뇌, 신경 문장 또는 periotic mesenchyme에 기본 효과의 귀가 아닌 보조 효과로 이동 효과 시험.
Protocol
Discussion
우리는 성공적으로 24 HPF의 zebrafish 배아의 귀에에 안티 센스 oligonucleotide의 수법의 살인인를 도입했습니다. 분사와 electroporation 이후 자랐던 공룡의 태아가 가능한되었습니다. 배아의 electroporation에서 살아남는다면, 그들은 치료뿐만 아니라 전용 주입에만 electroporated 있었다 배아 있었다 배아를받은 적이 없음 배아에 비해 정상적인 속도로 증가했다.
우리는 phalloidin과 acetylated tubulin과 라벨을 통해 귀 분사와 electroporation 후 MIF 및 MIF 같은 수법의 살인인의 효과를 관찰했다. 뒷부분 망막의 황반의 감각 세포에있는 굴지의 필라멘트의 Phalloidin의 얼룩은 수법의 살인인로 주입되었다 배아에 비해 머리카락 세포 및 / 또는 stereocilia 번호의 변화를 일으킨 MIF와 24 HPF 단계에서 MIF와 같은 MO의 electroporation을 나타냅니다 (그림 3). 헤어 셀 번호에있는이 감소는 쉔 외의 결과와 일치합니다. (제출) MIF 및 MIF처럼하는 수법의 살인인 걸 saccular 망막의 황반에있는 세포의 수를 감소의 원인이되는. 그 electroporation을 설명 수법의 살인인 및 electroporated로 주입되었다 태아의 머리 세포 숫자의 감소함으로써 귀의 소포에만 주입어진 배아에 비해 형태학의 효과의 범위를 증가, 세포막에 걸쳐 수법의 살인인 이동에 도움이됩니다. statoacoustic 신경절의 형태의 변경은 acetylated tubulin의 얼룩을 통해 관찰했다. statoacoustic 신경절에 의해 innervation의 범위는 주입과 공연이 neurites (그림 5)의 분기 감소 electroporated되었습니다 배아으로 영향을했습니다. acetylated tubulin의 얼룩이 크게 주입하고 electroporated 있었다 모두 배아 감소하기 때문에 또한, ganglionic 세포 및 / 또는 신경절 세포의 감소 번호 결로가 발생 감소있을 수 있습니다. MIF는 신경 시스템 개발 (스즈키 외., 2004)에 중요한 것으로 표시 되었기 때문에, electroporation 후 본 변경 사항은 MIF 및 MIF 같은 neuroblast 세포에 MO 솔루션입니다. 증가 transfection 결과 수 있습니다
직접 개발 조직으로 안티 센스 oligo morpholinos의 Electroporation은 배아에서 조직 개발하는 동안 유전자 모두 공간과 temporally의 표현을 제어하기위한 유용한 도구입니다. MIF와 내이 (内耳)의 조직에 수법의 살인인 MIF처럼의 Electroporation은 사후 망막의 황반과 statoacoustic 신경절 모두 비정상적인 형태의 결과. 어느에만 주사 또는 유일한 electroporated했다 배아 또는 전혀 치료를받은 적이 없음 배아에 비해 주입하고 electroporated 있던 태아의 사후 망막의 황반에있는 감각 세포의 수가 감소가 발생했습니다. statoacoustic 신경절 및 SAG의 크기에 의해 사후 감각 패치 innervation의 정도에 감소도 발생했습니다. Electroporation 원하는 조직에서 특정 DNA, RNA, 또는 MO의 주요 효과를 관찰하고 다른 조직에있는 보조 효과에서 이들을 차별, 뇌, 신경 문장을 포함하여의 이익과 특정 조직에 macromolecules를 transfecting위한 가치있는 방법입니다 내이 (内耳)의 개발에 periotic mesenchyme (Barald와 켈리, 2004).
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 KFB에 난청 연구 재단에서 YC S 및 NSF (IOS 0,930,096)를 부여 지원했다.
KFB : NIH / NINDCD이 RO1 DC04184, 3R01DC004184 – 08W1 , NSF DBI 0,832,862, NSF IOS 0,930,096
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon |
- MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used.
Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5′-acatcggcatgactgcgacagagat-3′. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5′-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3′, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5′-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3′. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3′. - methylene blue (0.3 ppm) in fish water
- MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water)
- Low-melting point agarose (LMPA; Roche)
- phenol red (Sigma)
- Anti-acetylated tubulin (Sigma)
- Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes)
- Texas red-phalloidin (Molecular probes)
Referências
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
