Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell'orecchio interno
Summary
Un metodo per fornire Morpholinos direttamente nel otocyst pesce zebra a 24hpf è stato sviluppato. Mediante microiniezione di Morpholinos nel lume del vescicola otica ed elettroporazione di effettuare la penetrazione, siamo stati in grado di bypassare l'effetto di Morpholinos sul cervello e ottenere effetti specifici per l'orecchio interno.
Abstract
Negli ultimi anni, elettroporazione è diventata una tecnica popolare per la transfezione in vivo di DNA, RNA, e Morpholinos in vari tessuti, tra cui l'occhio, il cervello, e somiti di zebrafish. Il vantaggio di elettroporazione rispetto ad altri metodi di manipolazione genetica è che i tessuti specifici possono essere mirati, sia spazialmente e temporalmente, per l'introduzione di macromolecole con l'applicazione di corrente elettrica. Qui si descrive l'utilizzo di elettroporazione per la trasfezione mif e mif-come Morpholinos nei tessuti dell'orecchio interno lo sviluppo del pesce zebra. In studi precedenti, mif morfolino iniettate in embrioni a 1 – a stadio di 8 cellule portato a cambiamenti morfologici diffusi nel sistema nervoso e degli occhi, così come l'orecchio. Prendendo di mira i tessuti dell'orecchio interno nelle fasi successive dello sviluppo, possiamo determinare gli effetti primari di MIF nell'orecchio sviluppo interno, al contrario di effetti secondari che possono derivare da l'influenza di altri tessuti. Utilizzando tubulin falloidina e acetylated colorazione per studiare la morfologia dei neuroni, processi neuronali e cellule ciliate associati con la macula posteriore, siamo stati in grado di valutare l'efficacia di elettroporazione come metodo per la trasfezione mirati nell'orecchio zebrafish interno. Le vescicole otic di embrioni 24hpf sono stati iniettati con Morpholinos e elettroporate e sono stati poi confrontati con embrioni che avevano ricevuto alcun trattamento o erano stati solo iniettato o elettroporate. Embrioni che sono stati iniettati e elettroporate ha mostrato una diminuzione del numero delle cellule dei capelli, diminuzione della innervazione dal ganglio statoacoustic (SAG) e neuroni SAG meno rispetto ai gruppi di controllo. I nostri risultati hanno mostrato che la consegna diretta dei Morpholinos in otocysts nelle fasi successive evita la non specifico del sistema nervoso e gli effetti della cresta neurale Morpholinos consegnato in fase di 1-8 cellule. Consente inoltre l'esame degli effetti che sono diretti per l'orecchio interno e non effetti secondari su un orecchio da effetti primari sul cervello, cresta neurale o mesenchima periotica.
Protocol
Discussion
Noi abbiamo introdotto con successo MOS oligonucleotide antisenso nell'orecchio dell'embrione 24 zebrafish HPF. Embrioni che sono state sollevate dopo l'iniezione ed elettroporazione sono stati vitali. Se gli embrioni sono sopravvissuti l'elettroporazione, sono cresciuti a tassi normali rispetto agli embrioni che avevano ricevuto alcun trattamento, così come gli embrioni che erano stati soltanto iniettato e gli embrioni che era stato solo elettroporate.
Abbiamo osservato gli effetti della commissione interbancaria multilaterale e mif-MOS, come dopo l'iniezione orecchio ed elettroporazione attraverso l'etichettatura con falloidina e tubulina acetilata. Colorazione falloidina di filamenti di actina in cellule ciliate sensoriali della macula posteriore indica che l'elettroporazione di mif e mif-come MO al 24-HPF stadio causato cambiamenti nella cella dei capelli e / o numeri stereocilia rispetto agli embrioni che erano solo iniettato il MOS (Figura 3). Questa diminuzione del numero di cellule dei capelli è coerente con i risultati di Shen et al. (Inviato) che MOS a mif e mif simile a causare una riduzione del numero di cellule ciliate nella macula sacculare. La diminuzione del numero di cellule dei capelli in embrioni che sono stati iniettati con MOS e elettroporate dimostrare che elettroporazione può aiutare nello spostamento del MOS attraverso la membrana cellulare, aumentando così la portata degli effetti morfologici rispetto agli embrioni in cui la vescicola otica era solo iniettato. I cambiamenti nella morfologia del ganglio statoacoustic sono stati osservati attraverso la colorazione tubulina acetilata. Il grado di innervazione del ganglio statoacoustic ha risentito, come gli embrioni che sono stati iniettati e elettroporate mostrano diminuzione ramificazione dei neuriti (Figura 5). Ci possono anche essere ridotta di condensazione delle cellule gangliari e / o riduzione del numero di cellule gangliari, perché la colorazione tubulina acetilata è significativamente diminuito negli embrioni che sono stati entrambi iniettato e elettroporate. Perché mif ha dimostrato di essere fondamentale per lo sviluppo del sistema nervoso (Suzuki et al., 2004), i cambiamenti osservati dopo l'elettroporazione può essere il risultato di trasfezione aumentato del MIF e mif-come MO soluzione nelle cellule neuroblasti.
Elettroporazione di oligo antisenso Morpholinos direttamente in un tessuto di sviluppo è uno strumento utile per controllare l'espressione di un gene durante lo sviluppo del tessuto che, sia spazialmente e temporalmente, nell'embrione. Elettroporazione di mif e mif-MOS, come nei tessuti dell'orecchio interno portato a morfologia anormale sia della macula posteriore e il ganglio statoacoustic. C'è stata una riduzione del numero delle cellule ciliate sensoriali nella macula posteriore negli embrioni che erano stati iniettati e elettroporate rispetto a embrioni che non aveva ricevuto alcun trattamento o con embrioni che erano stati o solo iniettata o solo elettroporate. C'era anche una diminuzione del grado di innervazione della patch posteriore sensoriali dal ganglio statoacoustic e la dimensione del SAG. L'elettroporazione è un metodo prezioso per trasfezione macromolecole nei tessuti specifici, con il vantaggio di osservare gli effetti primari di quel particolare DNA, l'RNA, o MO nel tessuto desiderato e discriminante da questi effetti secondari su altri tessuti, compreso il cervello, cresta neurale e mesenchima periotica sullo sviluppo dell'orecchio interno (Barald e Kelley, 2004).
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione per la Ricerca Sordità al Yc S e la NSF (IOS 0.930.096) alla KDB.
KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, 0930096 NSF IOS
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon |
- MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used.
Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5′-acatcggcatgactgcgacagagat-3′. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5′-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3′, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5′-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3′. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3′. - methylene blue (0.3 ppm) in fish water
- MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water)
- Low-melting point agarose (LMPA; Roche)
- phenol red (Sigma)
- Anti-acetylated tubulin (Sigma)
- Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes)
- Texas red-phalloidin (Molecular probes)
Referências
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
