Прямая доставка MIF Morpholinos Into данио рерио отоцист путем инъекций и Электропорация влияет на внутреннее развитие уха
Summary
Метод доставить morpholinos непосредственно в данио отоцист на 24hpf была разработана. Использование микроинъекции morpholinos в просвет слухового пузыря и электропорации осуществить проникновение, мы смогли обойти влияние morpholinos на мозг и получить эффекты, характерные для внутреннего уха.
Abstract
В последние годы электропорации стала популярная техника для прижизненного трансфекции ДНК, РНК и morpholinos в различные ткани, включая глаза, головной мозг, и сомитов из рыбок данио. Преимущество электропорации по сравнению с другими методами генетических манипуляций в том, что специфические ткани могут быть направлены, как в пространстве и во времени, для введения макромолекул путем применения электрического тока. Здесь мы опишем использование электропорации трансфекции и MIF MIF-как morpholinos в тканях развивающегося внутреннего уха рыбок данио. В прошлых исследованиях, MIF морфолино вводят эмбрионов на 1 – 8-клеточной стадии привело к широкому распространению морфологические изменения нервной системы и глаз, а также ухо. По ориентации ткани внутреннего уха на более поздних стадиях развития, мы можем определить первичный эффект MIF в развивающемся внутреннем ухе, в отличие от вторичных эффектов, которые могут возникнуть в результате влияния других тканях. При использовании фаллоидином и ацетилированного тубулина окрашивания для изучения морфологии нейронов, нейронных процессов, а волосковых клеток связана с задним макулы, мы смогли оценить эффективность электропорации в качестве метода для целевой трансфекции в данио внутреннего уха. Слуховых пузырьках из 24hpf эмбрионы были введены с morpholinos и электропорации, а затем были по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения, либо были только вводили или электропорации. Эмбрионы, которые были введены и электропорации показали снижение численности волосковых клеток, снижение иннервации по statoacoustic ганглии (SAG) и меньше SAG нейронов по сравнению с контрольными группами. Наши результаты показали, что прямые поставки morpholinos в otocysts на более поздних этапах позволяет избежать неспецифической нервной системы и нейронные эффекты гребне morpholinos доставлен в 1-8 клеточной стадии. Она также позволяет исследовать эффекты, которые направлены на внутреннее ухо, а не вторичные эффекты на ухо от первичного воздействия на мозг, нервного гребня или околоушный мезенхимы.
Protocol
Discussion
Мы успешно внедрили МО антисмысловых олигонуклеотида в ухо 24 эмбрионов данио HPF. Эмбрионы, которые были поставлены после инъекции и электропорации были жизнеспособными. Если эмбрионов выжили электропорация, они выросли по обычным ставкам по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения, а также эмбрионы, которые только были введены и эмбрионов, которые были только электропорации.
Мы наблюдали эффект MIF и MIF-МО, как после инъекции уха и электропорация с помощью маркировки с фаллоидином и ацетилированного тубулина. Фаллоидином окрашивания актиновых филаментов в волосковых клеток задней макулы указывает, что электропорации MIF и MIF-MO, как в 24-HPF этапе вызванные изменениями в волосковых клеток и / или стереоцилий номера по сравнению с эмбрионами, которые только вводят МО (рис. 3). Это снижение численности волосковых клеток согласуется с выводами Шень и соавт. (Представлено), что МО в MIF и MIF-как причина сокращения числа волосковых клеток в саккулярной макулы. Снижение численности волосковых клеток в эмбрионы, которые были введены с МО и электропорации продемонстрировать, что электропорации может помочь в продвижении МО через клеточную мембрану, тем самым повышая степень морфологические эффекты по сравнению с эмбрионами, в котором слуховым пузырьком только вводили. Изменения в морфологии statoacoustic ганглия наблюдали через ацетилированного окрашивания тубулина. Степени иннервации по statoacoustic ганглия пострадал, так как эмбрионы, которые были введены и электропорации шоу снизилась ветвление нейритов (рисунок 5). Там также может быть уменьшен конденсации ганглиозных клеток и / или снижение количества ганглиозных клеток, так как ацетилированный окрашивания тубулина значительно уменьшились в эмбрионов, которые были и вводят и электропорации. Потому что MIF было показано, что иметь решающее значение для развития нервной системы (Suzuki и соавт., 2004), изменения, наблюдаемые после электропорации может быть результатом увеличения трансфекции и MIF MIF-MO, как раствор в нейробластов клеток.
Электропорация антисмысловых олиго morpholinos непосредственно в развивающихся тканей является полезным инструментом для управления экспрессию гена в процессе развития, что ткани, оба во времени и пространстве, в зародыше. Электропорация Мифа и MIF-МО, как в ткани внутреннего уха в результате ненормальной морфологии оба задних макулы и statoacoustic ганглия. Существовал сокращение числа волосковых клеток в задней макулы у эмбрионов, которые были введены и электропорации по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения или эмбрионов, которые были либо только вводят или только электропорации. Существовал также снижение степени иннервации задних сенсорных патч statoacoustic ганглия и размер SAG. Электропорация является ценным методом трансфекции макромолекул в конкретной ткани, с выгодой для наблюдения первичных эффектов, что особенно ДНК, РНК, или МО в нужной ткани и дискриминацию их от вторичных эффектов на другие ткани, в том числе головного мозга, нервного гребня и околоушный мезенхимы на внутреннее развитие уха (Barald и Келли, 2004).
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами фонда исследований Глухота к Yc S и NSF (IOS 0930096) на КФБ.
КФБ: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, 0930096 NSF IOS
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon |
- MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used.
Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5′-acatcggcatgactgcgacagagat-3′. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5′-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3′, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5′-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3′. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3′. - methylene blue (0.3 ppm) in fish water
- MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water)
- Low-melting point agarose (LMPA; Roche)
- phenol red (Sigma)
- Anti-acetylated tubulin (Sigma)
- Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes)
- Texas red-phalloidin (Molecular probes)
Referências
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
