Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling
Summary
Een methode om rechtstreeks te leveren morpholinos in de zebravis otocyst op 24hpf is ontwikkeld. Met behulp van micro-injectie van morpholinos in het lumen van otic blaasje en elektroporatie tegen penetratie effect, waren we in staat om het effect van morpholinos op de hersenen te omzeilen en de effecten die specifiek zijn voor het binnenoor te verkrijgen.
Abstract
In de afgelopen jaren, is elektroporatie uitgegroeid tot een populaire techniek voor in vivo transfectie van DNA, RNA, en morpholinos in verschillende weefsels, waaronder de ogen, de hersenen en somieten van de zebravis. Het voordeel van elektroporatie ten opzichte van andere methoden van genetische manipulatie is dat de specifieke weefsels kan worden gericht, zowel ruimtelijk als in de tijd, voor de invoering van macromoleculen door de toepassing van elektrische stroom. Hier beschrijven we het gebruik van elektroporatie voor transfecteren MIF pt mif-achtige morpholinos in het weefsel van de zich ontwikkelende binnenoor van de zebravis. In eerdere studies, mif morfolino geïnjecteerd in embryo's op de 1 – tot 8-cellig stadium geleid tot grootschalige morfologische veranderingen in het zenuwstelsel en het oog, evenals het oor. Door zich te richten de weefsels van het binnenoor in latere stadia van ontwikkeling, kunnen we bepalen de primaire effecten van de MIF in de ontwikkelingslanden binnenoor, in tegenstelling tot secundaire effecten die kunnen voortvloeien uit de invloed van andere weefsels. Door gebruik te maken phalloidin en geacetyleerd tubuline vlekken op de morfologie van neuronen, neurale processen en haarcellen worden geassocieerd met het achterste macula studie, waren we in staat om de werkzaamheid van elektroporatie te beoordelen als een methode voor gerichte transfectie in de zebravis binnenoor. De blaasjes Otic van 24hpf embryo's werden ingespoten met morpholinos en geëlektroporeerd en werden vervolgens vergeleken met embryo's die waren kregen geen behandeling of waren alleen geïnjecteerd of geëlektroporeerd. Embryo's die werden geïnjecteerd en geëlektroporeerd lieten een afname in haar cel aantallen, verminderd innervatie door de statoacoustic ganglion (SAG) en minder SAG neuronen in vergelijking met controlegroepen. Onze resultaten toonden aan dat de directe levering van morpholinos in otocysts in latere stadia van de niet-specifieke zenuwstelsel en de neurale lijst effecten van morpholinos geleverd op de 1-8 cellig stadium voorkomt. Het staat ook het onderzoek van effecten die zijn gericht op het binnenoor en niet secundaire effecten op het oor van de primaire effecten op de hersenen, neurale lijst of periotic mesenchym.
Protocol
Discussion
We hebben met succes geïntroduceerd antisense oligonucleotide MO's in het oor van de 24 HPF zebravis embryo. Embryo's die zijn gerezen na de injectie en elektroporatie waren levensvatbaar zijn. Als de embryo's overleefde de elektroporatie, groeiden ze tegen normale tarieven in vergelijking met embryo's die waren kreeg geen behandeling, maar ook embryo's die alleen waren geïnjecteerd en embryo's die alleen was geweest geëlektroporeerd.
We de effecten van MIF pt MIF-achtige MO's waargenomen na oor injectie en elektroporatie door middel van etikettering met phalloidin en geacetyleerde tubuline. Phalloidin kleuring van actine filamenten in sensorische haarcellen van het achterste macula geeft aan dat elektroporatie van de MIF pt MIF-achtige MO bij de 24-HPF stadium veroorzaakt veranderingen in haar cel en / of stereocilia cijfers in vergelijking met embryo's die alleen werden geïnjecteerd met de MO's (Figuur 3). Deze daling in het haar cel aantallen in overeenstemming is met de bevindingen van Shen et al.. (Ingediend) dat MO's te MIF pt MIF-achtige leiden tot een vermindering van het aantal van de haarcellen in het zakvormig macula. De afname in haar cel aantallen in embryo's die werden geïnjecteerd met MOS en geëlektroporeerd aantonen dat elektroporatie kunnen helpen bij het verplaatsen van de MO's over het celmembraan, waardoor de omvang van de morfologische effecten in vergelijking met embryo's in de otic blaasje enige was geïnjecteerd. Veranderingen in de morfologie van de statoacoustic ganglion werden waargenomen door geacetyleerde tubuline vlekken. De omvang van innervatie door de statoacoustic ganglion werd beïnvloed, omdat embryo's die werden ingespoten en geëlectroporeerd tonen verminderde vertakking van de neurieten (figuur 5). Er kan ook worden verminderd condensatie van de ganglien-cellen en / of het verminderd aantal ganglioncellen, omdat de geacetyleerde tubuline kleuring is significant verlaagd in embryo's die zowel geïnjecteerd en geëlectroporeerd. Omdat mif is aangetoond kritisch te zijn voor de ontwikkeling van het zenuwstelsel (Suzuki et al.., 2004), kan de veranderingen gezien na elektroporatie het gevolg zijn van verhoogde transfectie van de MAV pt MAV-achtige MO oplossing in het neuroblast cellen.
Elektroporatie van antisense oligo morpholinos direct in het ontwikkelen van een weefsel is een nuttig instrument voor het regelen van de expressie van een gen tijdens de ontwikkeling dat weefsel, zowel ruimtelijk als in de tijd, in het embryo. Electroporatie van mif pt MIF-achtige MO's in de weefsels van het binnenoor resulteerde in een abnormale morfologie van zowel de achterste macula en de statoacoustic ganglion. Er was een vermindering van het aantal van sensorische haarcellen in het achterste macula in embryo's die waren geïnjecteerd en geëlektroporeerd in vergelijking met embryo's die waren ontvangen geen behandeling of met embryo's die ofwel slechts geïnjecteerd of alleen geëlektroporeerd. Er was ook een daling in de mate van innervatie van de achterste sensorische patch door de statoacoustic ganglion en de grootte van de SAG. Elektroporatie is een waardevolle methode voor transfecteren macromoleculen in specifieke weefsels, met het voordeel van het observeren van de primaire effecten van dat DNA, RNA, of MO in de gewenste weefsel en onderscheid deze van secundaire effecten op andere weefsels, waaronder de hersenen, neurale lijst en periotic mesenchym op binnenoor ontwikkeling (Barald en Kelley, 2004).
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deafness Research Foundation te Yc S en de NSF (IOS 0.930.096) naar KFB.
KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon |
- MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used.
Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5′-acatcggcatgactgcgacagagat-3′. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5′-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3′, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5′-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3′. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3′. - methylene blue (0.3 ppm) in fish water
- MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water)
- Low-melting point agarose (LMPA; Roche)
- phenol red (Sigma)
- Anti-acetylated tubulin (Sigma)
- Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes)
- Texas red-phalloidin (Molecular probes)
Referências
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
