Dilim hazırlanması, Organotipik Doku ekimi ve suprakiazmatik nükleus Saat Gen Faaliyet Lusiferaz Kayıt
Summary
Yetişkin fare hipotalamik suprakiazmatik nükleus (SCN) ve kültür ile hızlı bir şekilde Organotipik kültür durumda SCN doku içeren dilimleri, hazırlama prosedürü rapor edilmiştir. Ayrıca, salınım saat gen protein ekspresyonu dinamik lusiferaz muhabiri teknolojisini kullanarak ölçüm açıklanmıştır.
Abstract
Fizyoloji ve davranış günlük ritimlerin koordinasyon merkezi bir sirkadiyen (24 saat) saat anterior hipotalamusta bulunan suprakiazmatik nükleus (SCN) bulunur. Saat doğrudan ışık retina ve optik sinir vasıtasıyla senkronize edilir. Sirkadiyen salınımlar negatif geri besleme döngüleri etkileşim Dönem (Kişi) genler de dahil olmak üzere, sözde "saat genleri" ve bunların protein ürünleri, bir dizi oluşturulur . Çekirdek saat membran depolarizasyon, kalsiyum ve cAMP 1 bağlıdır. SCN saat gen ekspresyonu, metabolik aktivite ve spontan elektriksel aktivite günlük salınımlar gösterir. Enteresandır ki, bu endojen siklik aktivite SCN 2-4 yetişkin doku dilimler halinde devam etmektedir. Bu şekilde, biyolojik saat, pacemaker fonksiyonunun moleküler, elektrofizyolojik ve metabolik incelemeler izin in vitro okudu olabilir .
SCN optik kiazma 5 sağ üstünde yer alan küçük, iyi tanımlanmış ikili yapı. Sıçan her çekirdeğinde ~ 8.000 nöron içeren ve yaklaşık 947 mm (uzunluk, rostro ekseni) x 424 mm (genişlik) x 390 mm (yükseklik) 6 boyutlara sahip. SCN tespit edilebilir beynin belirli bir düzeyde bir beyin dilim kesmek için gerekli olan SCN incelemek. Burada, fare ve sıçan beyinlerinde benzer SCN, diseksiyon ve dilimleme prosedürü açıklar. Ayrıca, biz nasıl bir zar 7, Yamazaki ve ark SCN doku kültürü için geliştirilmiş bir tekniktir organotypically disseke doku kültürü göstermektedir. 8. Son olarak, transgenik dokusu, dinamik lusiferaz muhabiri teknoloji, başlangıçta Geusz ve ark sirkadiyen ölçümler için kullanılan bir yöntem. 9 saat genler / proteinler ifade ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir . Biz burada transgenik SCN dokuları kullanmak PERIOD2-vurmak: Yoo ve ark tarafından üretilen Lusiferaz fareler 10. Fareler DÖNEM bir füzyon proteini (PER) 2 ve ateşböceği enzim Lusiferaz içerir. Lusiferaz luciferase oksidasyonunu katalize zaman PER2 lucifeares, yani luciferase substrat varlığında tercüme edilir, PER2 ifade biyoparlaklık olarak takip edilebilir. Fotonların sayısını olumlu üretilen PER2 protein miktarı ile ilişkilidir ve biyoparlaklık ritimleri, in vivo 10 PER2 protein ritim maç . Bu şekilde PER2 ifade siklik değişkenlik birçok gün boyunca sürekli gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Doku kültür ve gerçek zamanlı biyoparlaklık kayıt için takip protokolü Yamazaki ve Takahashi 11 tarafından iyice tarif edilmiştir.
Protocol
Discussion
Lusiferaz muhabiri teknolojisi ile Avantajlar ve dezavantajlar
Gündüz çalışma için birçok farklı zaman noktalarında (normalde 2-4 saat Örnekleme frekansına bağlı olarak düşük bir zaman çözünürlüğü veren) doku örnekleme gerektiren in situ hibridizasyon ve Western blot, RT-PCR gibi ex vivo yöntemler, aksine gen ve protein ifadelerde değişiklikler lusiferaz muhabiri teknolojisi, yüksek çözünürlük (1-10 dk) aynı hazırlık kaç gün sirkadiyen salınımlar çalışmaları sağlar. Böylece, kullanılan hayvanların sayısı en aza indirgenecektir ve detaylı çalışmalar faz ritim ve dönem üzerindeki etkileri, normalde düşük zaman çözünürlüğü ile geleneksel örnekleme teknikleri kullanarak mümkün değildir, mümkün. Ancak, ritim göreceli genlik ölçümleri mümkün olmasına rağmen, muhabir teknoloji kantitatif değildir ve bu nedenle transkripsiyonu genler veya tercüme proteinlerin miktarlarını ölçmek için kullanılamaz vurguladı olmalıdır.
Doku kayıtlar Organotipik SCN kültürü yetişkin beyin uzun vadeli (hafta) farmakolojik manipülasyon sağlar kültür, doğrudan, in vivo ışık kaynaklı faz vardiya vb, in vivo stres moleküler etkileri eğitim için büyük bir avantaj hemen sonra başlamış ve analiz edilebilir sağlam bir olgun sinaptik ağ ve lusiferaz muhabiri teknolojisi içeren doku, birkaç hafta için kararlı kayıtları sağlar. Böylece, doku yenidoğan veya erken doğum sonrası sağlıklı kültürleri elde etmek için ihtiyaç değildir ve akut dilim kronik farmakolojik tedavilerin aksine yapılabilir. Epigenetik değişikliklerin incelenmesi gereken hücre kültürlerinde DNA genomu içine dahil edilmesi için herhangi bir neden? Plazmid-muhabiri transfections aksine, lusiferaz transgenik hayvan modelleri (yanı sıra Lenti-virüs transfections) tercih edilir. Bu bağlamda da lüminesans görüntüleme kayıtları bile sirkadiyen ritimler okuyan büyük laboratuvarlar tarafından kullanılan tek SCN nöron (~ 6-10 mikron) ve diğer hücre tipleri, izin, günümüzde çok hassas CCD kamera 11 ile mümkün olduğu belirtilmelidir. Son olarak, birkaç sirkadiyen araştırmacılar yaygın saat gen / protein salınımlar 16-19 araştırmak için diğer muhabirler, Yeşil Floresan Protein gibi kullanarak moleküler ifade izleme kullanın.
Kesit kalınlığı Yönleri
Burada önerilen SCN dilim kalınlıkları (200-300 mikron), azalmış ya da istenirse artmış olabilir. Ancak, doku kültüründe bir kaç gün sonra membran üzerinde düzleştirir rağmen, 7 doku canlılığı korumak için başlangıçta kesilmiş dilim 500 mikron kalınlığında aşmak için tavsiye değildir. 100 mikron daha ince bir dilim işlemek için zor bir mekanik ve pratik nedenlerle. SCN (örneğin "kabuk", ve dorsal karşı ventral bölgelerde karşı "çekirdek") içinde farklı bölgelerde farklı aşamalarına salınım SCN dokusu heterojen olduğundan dilim kalınlığı lusiferaz çıkış sinyali faz etkileyebilir, çünkü 20 ve farklı aşamasından sonra yeniden senkronize 21 kaydırır. Daha fazla doku, daha büyük bir sayıda fotonlar yayar beri dilim kalınlığı da foton sayısı temel etkiler. Moleküler salınım genliği eksplant boyutunu bu şekilde dolaylı olarak etkilenebilir. Bu nedenlerden dolayı, kontrol ve tedavi kültürler her zaman aynı boyutta, kalınlık ve SCN aynı bölgede aynı fazda ve aynı genlikli salınım amacıyla içeren olmalıdır. Iki tek taraflı çekirdekleri, diğer taraftan, birbiri ile ve sürece benzer genlikleri faz salınım vibratome kesme açılı (sırayla, beyincik ve iki yarımküresinin arasında kesme ayırma dik olduğunu bağımlı olduğu değil, yatay olarak masa yüzeyi). SCN kültür gerçekleştiren bir araştırmacı SCN kültürlerin birbirleriyle faz salınım olmadığını yaşayabilirsiniz. Dilimleme tekniği Uygulama ve standardizasyon SCN postero-kaudal aynı seviyede, her zaman dilimleri kesilir yani, sonuç artıracak.
Kritik adımlar
- Oksijen kaynağı kritik öneme sahiptir.
Beynin bir çok oksijen 22 gerektirdiğinden, dilimleme işlemi hızlı olması gerekir (3,1-3,10 ne kadar yakınsa o kadar iyi doku sağlıklı tutmak için ~ 5-6 dakika). - SCN sıcaklık değişimleri ve orta döviz duyarlıdır.
SCN ısıya duyarlı ve büyük sıcaklık değişimleri, faz kalp pili kayması ve deneysel eserler 23 neden olabilir . Orta ya da çözümleri örneğin kültür birkaç gün sonra bir ilaç uygulanarak devam eden bir deney, orta ya da eriyik sırasında değiştirilebileceği veya eklenirsen önceden ısıtılmış 36-37 için ° C (odasında aynı sıcaklık) önce eklenmesi gerekir. Orta değişimleri içeren farmakolojik deneyler, her zaman ön şartlı hücre kültür ortamı ile çalışmak önemlidir. Toplama / taze yıkayın, koşulsuz orta potansiyel moleküler SCN ritim 24 gibi diğer hücre tipi kültürleri 25 vardiya faz yapabilirsiniz. - Orta kompozisyon.
Doğru pH ve osmolalitesi doku kültürü önemlidir. Hava-tamponlama orta pH 6,8-8,2 aralığında optimal bir tampon kapasitesine sahip ve aynı zamanda hücre solunumunu bir sonucu olarak ortaya çıkabilir pH değişiklikleri tamponlama için uygun Hepes büyük miktarda içerir. Hepes, diğer taraftan, kültür ortamı az miktarda sodyum bikarbonat ile karşılaştırıldığında gibi sıcaklık değişikliklerine karşı daha duyarlıdır. Sodyum bikarbonat, böylece CO 2 atmosferde uygun düşük pH (5,1-7,1) 26 aralık, daha büyük bir tamponlama kapasitesine sahiptir . Ancak, hava-tamponlama orta (DMEM 2902) sodyum bikarbonat miktarda artış osmolalitesi önemli ölçüde artırır ve aynı zamanda orta, amino asitler, vitaminler ve iyonların yanlış kompozisyon teslim sonuçları. Inceltmeden eklenemez
Ortamın hazırlanması için tavsiyeler:- Orta karıştırma zaman hassas ve dikkatli olun.
- Yalnızca taze ya da taze çözülmüş stok çözümleri kullanın.
- Bir çok yüksek osmolalitesi durumda seyreltilmesi değer değildir. % 5-6 daha seyreltilmiş orta büyük olasılıkla çalışmayacaktır. D-glukoz, çok düşükse osmolalitesi artırmak için kullanın.
- Faz hazırlık süresi nedeniyle vardiya
Dilim hazırlık zamanı kritik önem taşımaktadır. Dilim prosedürü ZT 06-12 Aralık tarihleri arasında yapılan faz sıfır ya da minimal etkisi elde edilir. Tüm dilim diseksiyonları hazırlıkları arasındaki faz değişimi nedeniyle hata en aza indirmek için, gündüz ya da sirkadiyen döngüsünün aynı aşamasında yapılmalıdır.
Olası değişiklikler
- Dilimleme başlamadan önce oksijen (% 95 O 2,% 5 CO 2) ile doymuş tampon, akut SCN elektrofizyoloji, dilimleme Ringer (ACSF Yapay Cerebro Spinal Akışkan) ile yapılacak. Ayrıca, oksijen, elektrik ve sinaptik aktivite 22 oksijen kaynağı doğrudan bağımlı olduğu gibi, tüm dilimleme işlemi sırasında tampon sürekli eklenen olması gerekiyor .
- Yatay ve sagital dilimleri de başarıyla hazırlanmış ve SCN, kültür. Yazarlar koronal kesim ile karşılaştırıldığında bizim deneyimine göre daha düşük genlik ile sirkadiyen salınımlar vermek yatay dilim lusiferaz kayıtları ile deneyime sahip.
- SCN yaklaşık 1 mm uzunluğunda postero-kaudal ve dilimleme tekniği burada açıklanan merkezi bölgede bir SCN bölümünde elde doğru hedeflenmektedir. Ancak, birden fazla SCN bölümünde SCN çekirdeği, daha rostral karşı kaudal seviyelerde sirkadiyen gen / protein ekspresyonu soruşturma izin, fare ve sıçan beyinlerinde elde edilebilir.
- Dilim kültürleri, hatta genç hayvanlar, doğum sonrası yavrular veya embriyolar da hazırlanmış olabilir. Beyin ve kafatası çok genç yavrular çok yumuşak ve duyarlı olduğunu unutmayınız. Buna ek olarak, optik sinir ince ve tam olarak gelişmiş değil. SCN bölge hasarlı olup olmadığını böylece yavruların beyin diseksiyon dikkatli olunuz. Örneğin, onlar çok büyük, çünkü, mikro rongeur araçları fare yavrular kafatası açmak için kullanılır olamaz. Güzel makas genç yavrular yumuşak dokuları kesmek için yeterli.
- Burada açıklanan kapak cam tabanlı bir kültür tekniği, tek SCN nöronlar da, bir CCD / EM-CCD kamera kullanarak görüntü lüminesans için de kullanılabilir.
- PER2 olarak merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde ve transgenik PER2 periferik dokuların: LUC hayvanların kolayca osilasyonları açısından elde kültür ve analiz edilebilir: LUC ifadesi, diğer dokularda bir dizi de kaç gün gidip gelmeye devam ediyor ve hücre tipleri 10. Çoğu bu periferik dokularda, örneğin karaciğer için, hayatta kalmak için bir zar gerektirmez ama yerine doğrudan orta 11 banyolu kültür. Unutmayın, kültür ve orta değişimi nedeniyle kesit değişen bu faz SCN için aynı ilkeleri takip olmayabilir.
Önem
Transgenik fare ve sıçan suşu (: mPER2: LUC mPer1-luc 8, 10, 27) lusiferaz enzim aktivitesi, protein ya da gen ifadesi ritimleri yansıtır ve biyoparlaklık kayıt tespit edilebilir . Lusiferaz oluşturulan biyoparlaklık zayıf bir sinyal verir ama arka plan lüminesans bu yöntemi avantajlı, sıfıra yakın. Ayrıca, lusiferaz molekül dengesiz ve hızlı bir şekilde bozulmuş, çünkü hiçbir Tel varototoksisite, uzun vadeli eksitatör aydınlatma 28 sırasında ortaya çıkabilir. Birlikte ele alındığında, bu özellikleri uzun süren deneyler sirkadiyen araştırma lusiferaz muhabiri teknolojisi oldukça avantajlı hale izin verir.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FONCICYT 000000000091984; Jeansson temellerini Soderstrom Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist ve Sigurd och Elsa Bu çalışma İsveç Tıbbi Araştırma Konseyi (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3) tarafından finanse edildi Goljes Minne ve İsveç Tıp SLS-95151 Derneği. Profesör Gene D. Blok, UCLA, minnetle, el yazması değerli yorumları için kabul edilmektedir. Biz video mikroskobu sağlamak için Dr Michael Andäng ve Dr Helena Johard HCN kanal blokeri için teşekkür eder, ve Prof. Abdel El-Manira.
Etik hususlar:
Karolinska Enstitüsünde ve "Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd" tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak bütün hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. Tüm hayvan deneyleri olası stres ya da hayvana rahatsızlık en aza indirmek amacı ile yapılmaktadır.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| B27 supplement 50x | Invitrogen/Gibco | 17504-044 | ||
| Cover glasses | Menzel-Gläser | 40#1 | ≈ 40 mm | |
| Culture membranes | Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm | |
| DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma | D2902 | Powder for 1L | |
| Filter paper | Whatman | 1003 055 | ≈ 55 mm | |
| Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μm Polyethersulfone | |
| Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 | |
| HEPES | Invitrogen/Gibco | 15630-056 | 100 ml | |
| HBSS 10x | Invitrogen/Gibco | 14065-049 | 500 ml | |
| NaOCH3 7.5% | Invitrogen/Gibco | 25080-060 | 50 ml | |
| Luciferin | Promega | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt | |
| Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | ||
| PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | 100 ml | |
| Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm | |
| PMT | Hamamatsu | H9319-11MOD | ||
| Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 | |
| Vacuum filter | Fisher | 09-761-5 | ||
| Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | ||
| Vibratome | Campden Instruments |
Referências
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
- Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
- Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
- Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
- Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus–The mind’s clock. , 13-15 (1991).
- Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. a. y. Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
- Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- O’Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
- Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
- Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
- LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
- Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
- Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
- Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
- Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
- Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
- Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
- Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
- Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).
