Förfarandet för att förbereda skivor som innehåller den vuxna musen hypothalamus suprachiasmatiska kärnan (SCN), och en snabb väg till kulturen SCN vävnaden i organotypic kultur skick, redovisas. Vidare är mätning av oscillerande klockan gen protein uttryck med hjälp av dynamiska luciferas reporter teknik som beskrivs.
En central dygnsrytm (~ 24 tim) klocka samordna dygnsrytm i fysiologi och beteende är bosatt i suprachiasmatiska kärnan (SCN) i främre hypothalamus. Klockan är direkt synkroniseras av ljus via näthinnan och synnerven. Dygnsrytm svängningar genereras genom att interagera negativa återkopplingar av ett antal så kallade "klocka gener" och deras proteinprodukter, inräknat (Per) gener. Kärnan Klockan är också beroende av membran depolarisation, kalcium och cAMP 1. SCN visar dagliga svängningar klocka genuttryck, metabolisk aktivitet och spontan elektrisk aktivitet. Anmärkningsvärt, kvarstår detta endogena cyklisk aktivitet i vuxen vävnad skivor av SCN 2-4. På detta sätt kan den biologiska klockan lätt studeras in vitro, vilket gör att molekylär, elektrofysiologiska och metabola undersökningar av pacemakern funktion.
SCN är en liten, väldefinierad bilaterala strukturen ligger precis ovanför den optiska chiasm 5. Hos råtta innehåller ~ 8,000 neuroner i varje cellkärna och har dimensionerna ca 947 ìm (längd, rostrocaudal axeln) x 424 ìm (bredd) x 390 ìm (höjd) 6. Att dissekera ut SCN är det nödvändigt att skära en hjärna skiva på den specifika nivån i hjärnan där SCN kan identifieras. Här beskriver vi dela upp och skivas förfarande för SCN, som är likartad för mus och hjärna råtta. Vidare visar vi hur kulturen på dissekerade vävnaden organotypically på ett membran 7, en teknik som utvecklats för SCN vävnadsodling av Yamazaki et al. 8. Slutligen visar vi hur transgena vävnad kan användas för att mäta uttrycket av klockan gener / proteiner med hjälp av dynamiska luciferas reporter teknik, en metod som ursprungligen användes för dygnsrytm mätningar av Geusz et al. 9. Vi använder här SCN vävnader från den transgena knock-in perioden2:: luciferas möss som produceras av Yoo et al 10.. Mössen innehåller ett fusionsprotein periodens utgång (PER) 2 och för Firefly enzymet luciferas. När PER2 är översatt i närvaro av substrat för luciferas, dvs luciferin kan PER2 uttrycket övervakas som mareld när luciferas katalyserar oxidation av luciferin. Antalet utsända fotoner korrelerar positivt till mängden producerad PER2 protein, och mareld rytmer matcha PER2 proteinet rytmen in vivo 10. På detta sätt den cykliska variationen i PER2 uttryck kan övervakas kontinuerligt realtid under många dagar. Protokollet vi följer för mjukpapper odling och realtid mareld inspelning har noggrant beskrivits av Yamazaki och Takahashi 11.
Fördelar och nackdelar med luciferas reporter teknik
I motsats till ex vivo metoder, såsom RT-PCR, in situ hybridisering och Western blot som kräver vävnad provtagning vid flera olika tidpunkter (som ger en låg tidsupplösning på normalt 2-4 timmar beroende på samplingsfrekvens) för att studera diurnal variationer i genen och protein uttryck tillåter luciferas reportern teknik med hög upplösning (1-10 min) studier av dygnsrytm svängningar under många dagar i samma beredning. Således är antalet djur som används minimeras och detaljerade studier av effekter på fas och period av rytmen är genomförbara, vilket normalt inte är möjligt med hjälp av konventionella stickprovsmetoder med låg tidsupplösning. Även relativa amplitud mätningar av rytm är möjliga, bör det understrykas att reportern tekniken inte är kvantitativ och kan därför inte användas för att mäta mängder av transkriberade gener eller översatt proteiner.
Vävnaden inspelningar kan startas och analyseras omedelbart efter odling, en stor fördel för direkt studera molekylära effekter av in vivo stress in vivo ljusinducerad fas skift etc. organotypic SCN kulturen kan på lång sikt (veckor) farmakologisk manipulation av vuxna hjärnan vävnad som innehåller en intakt mogen synaptiska nätverk och luciferas reportern teknik tillåter stabil inspelningar för många veckor. Således behöver vävnaden inte neonatal eller tidigt efter födseln för att få friska kulturer, och i motsats till den akuta skiva kroniska farmakologiska behandlingar kan utföras. I motsats till plasmid-reporter transfections i cellodlingar, som inte leder till inkorporeringen av DNA i arvsmassan, den transgena luciferas-djurmodeller (liksom Lenti-virus transfections) är gynnsam om epigenetiska förändringar ska studeras. Det bör i detta sammanhang också nämnas att luminiscens bildbehandling är idag möjligt med mycket känsliga CCD-kameror 11, vilket gör att inspelningar även i enstaka SCN nervceller (~ 6-10 mikrometer) och andra celltyper, som används av stora laboratorier studera dygnsrytm. Slutligen flera dygnsrytm utredare använder ofta övervakning av molekylära uttryck med hjälp av andra reportrar, såsom det grönt fluorescerande proteinet, för att studera klockan gen / svängningar protein 16-19.
Aspekter på skiva tjocklek
Den här rekommenderas tjocklekar SCN skiva (200-300 mikrometer) kan minskas eller ökas om så önskas. Men även om vävnaden planar ut på membranet efter några dagar i kulturen, är det inte rekommenderat att överstiga 500 ìm tjocklek initialt skär skiva för att bevara livskraften i vävnaden 7. En skiva tunnare än 100 ìm är av mekaniska och praktiska skäl svårt att hantera. Eftersom SCN vävnaden är heterogen tjockleken på skiva kan påverka fasen av luciferas utsignalen, eftersom olika regioner i SCN (till exempel "kärnan" kontra "skal", och rygg kontra ventrala regioner) pendlar med olika faser 20 och differentiellt igen synkronisera efter fas skift 21. Tjockleken på den del påverkar också baslinjen fotonen räkna sedan mer vävnad avger ett större antal fotoner. Amplituden av molekylära svängningar kan på detta sätt indirekt påverkas av storleken på Explantation. Av dessa skäl bör kontrollera och behandlas kulturer alltid av samma storlek, tjocklek och innehåller samma region av SCN för att svänga i samma fas och med samma amplitud. De två ensidiga kärnor, å andra sidan, pendlar i fas med varandra och med liknande amplituder så länge vibratome klipp är horisontell och inte vinklad (som i sin tur är beroende av att separationen snitt mellan lillhjärnan och de två halvkloten är vinkelrät till bordet yta). En utredare som utför SCN odling kan uppleva att SCN kulturer inte pendlar i fas med varandra. Öva och standardisering av skivning tekniken, dvs skivor alltid skärs vid samma Rostro-caudal nivå i SCN kommer att förbättra resultatet.
Kritiska steg
Möjliga ändringar
Betydelse
I transgen mus och stammar råtta (mPER2:: Luc; mPer1-Luc 8, 10, 27) luciferas enzymaktiviteten speglar protein eller gen rytmer uttryck och kan bedömas genom bioluminescens inspelning. Den luciferas genererade mareld ger en svag signal men bakgrunden luminiscens är nära noll, vilket gör denna metod fördelaktigt. Dessutom, eftersom luciferas molekyl är instabil och snabbt bryts ner finns det ingen phototoxicitet, som kan visas under långvarig excitatoriska belysning 28. Sammantaget ger dessa egenskaper ger långvariga experiment gör luciferas reportern tekniken en stor fördel i dygnsrytm forskning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Svenska Medicinska forskningsrådet (K2009-75SX-21.028-01-3, K2008-61x-20700-01-3), FONCICYT 000000000091984, grundvalarna för Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist och Sigurd och Elsa Goljes Minne och Svenska Läkaresällskapet SLS-95.151. Professor Gene D. Block, UCLA, är tacksamt erkänd för värdefulla synpunkter på manuskriptet. Vi tackar Dr Michael Andäng och Dr Helena Johard för HCN-blockerare, och professor Abdel El-Manira för att tillhandahålla video-mikroskop.
Etiska överväganden:
Alla experiment på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Karolinska Institutet och "Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd". Alla djurförsök utförs med avsikt att minimera eventuella stress eller obehag för djuret.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
B27 supplement 50x | Invitrogen/Gibco | 17504-044 | ||
Cover glasses | Menzel-Gläser | 40#1 | ≈ 40 mm | |
Culture membranes | Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm | |
DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma | D2902 | Powder for 1L | |
Filter paper | Whatman | 1003 055 | ≈ 55 mm | |
Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μm Polyethersulfone | |
Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 | |
HEPES | Invitrogen/Gibco | 15630-056 | 100 ml | |
HBSS 10x | Invitrogen/Gibco | 14065-049 | 500 ml | |
NaOCH3 7.5% | Invitrogen/Gibco | 25080-060 | 50 ml | |
Luciferin | Promega | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt | |
Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | ||
PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | 100 ml | |
Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm | |
PMT | Hamamatsu | H9319-11MOD | ||
Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 | |
Vacuum filter | Fisher | 09-761-5 | ||
Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | ||
Vibratome | Campden Instruments |