Preparación Cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático

1. Preparación de la solución Medio de cultivo con una capacidad de amortiguación de aire Llenar una botella de 1 litro, con aproximadamente 800 ml estéril H 2 O (autoclave milliQ H 2 O). Mientras se agita, añadir y mezclar las sustancias siguientes: 1 contenedor de la glucosa baja, libre de suero en polvo DMEM 2902 sin bicarbonato de sodio y fenol rojo (rojo fenol interfiere con la señal de bioluminiscencia), 20 ml de suplemento B27 50x, 4,7 ml de un 7,5% de NaHCO3 solución (o 0,35 g de NaHCO 3), 10 ml de HEPES 1M, 2,5 ml Penstrep 10,000 U / mL y 3,5 g de D-glucosa. Que el medio revuelva hasta que los ingredientes se hayan disuelto completamente. El medio final (1 litro) contendrá: 1x DMEM, 1x suplemento B27, 4,2 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 25 U / ml de penicilina, 25 U / ml de estreptomicina y 19 mM D-glucosa. Ajustar el pH a 7,2, con NaOH o HCl para reducir al aumentar el pH, y llevar el volumen hasta 1 litro con agua estéril H 2 O. Ajustar la osmolaridad con H 2 O (osmolalidad disminución) o D-glucosa (osmolalidad de aumento). La osmolalidad debe estar entre 285-315 mOsm / Kg, pero el rango óptimo es 300 a 310 mOsm / Kg. No diluir el medio de más del 5%. Filtrar el medio de cultivo estéril con Corning establece filtración al vacío (por ejemplo, 2 x 500 ml con tamaño de poro 0.22 micras) en una campana estéril. Mantener el medio en el 4 ° C y protegerlo de la luz con papel de aluminio. Recomendamos que el medio se utiliza dentro de 3 meses. Hank equilibrado de solución de sal (HBSS) de búfer con los suplementos (por rodajas de corte) Llenar una botella de litro con un vaso estéril ~ 600 ml (autoclave milliQ) H 2 O y añadir las siguientes sustancias: 100 ml de caldo de HBSS 10 veces, 10 ml de penicilina-estreptomicina 10.000 U / ml, 5 ml de un 7,5% y solución de NaHCO3 10 ml de HEPES 1M. La solución de corte final contendrá: 1x HBSS, HEPES 10 mM, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / ml de penicilina y estreptomicina 100 U / mL. Verificar el pH y, si es necesario, ajustar el pH a 7.2 y llevar el volumen hasta 1 litro con agua estéril H 2 O. Compruebe la osmolaridad, que debe estar entre 285-315 mOsm / Kg. Enfriar la HBSS a 4 ° C. El buffer HBSS tiene que ser muy frío (4 ° C) durante el corte / corte de procedimiento con el fin de reducir el metabolismo y mantener la viabilidad del tejido. 2. Preparativos Antes Rebanadas de corte y cultivo Los tejidos se cultivaron en una cámara de calentamiento en seco sin CO 2. Para evitar que se sequen las culturas deben ser sellados con cubiertas de vidrio unido a los platos por la grasa. Para ello, llenar jeringas de 5 ml con grasa de vacío a base de silicona. Cubrir las puntas de jeringa con pequeños trozos de papel de aluminio y autoclave ellos. Además, los papeles de filtro autoclave (utilizado durante la corte de procedimiento). Justo antes de cortar el procedimiento, aplicar grasa de vacío en autoclave en la superficie superior del anillo de 35 mm placas de Petri. Preparar una placa de Petri separada para cada cultura rebanada. Antes de iniciar el procedimiento de corte de todos los instrumentos no estériles, navajas de afeitar, cuchillas vibratome, cubiertas de vidrio y otros materiales utilizados para el procedimiento de corte y la cultura tienen que ser esterilizados. Rocíe todo el equipo no estéril con etanol al 70%. Exponer los instrumentos y las placas de Petri engrasada con UV en una campana estéril durante al menos 30 minutos de exposición UV antes de cultivo. Al mismo tiempo, llenar un tubo Falcon con medio de cultivo aire-buffering (recuento de 1,2 ml de cada cultura, de 8 a prepararse para las culturas ml de medio ejemplo 10) y añadir recién descongelado luciferina (0,1 M de solución madre, Promega, Madison, WI) (10 l luciferina a 10 ml de medio, la concentración final de 0,1 mM). La luciferina es sensible a la luz y las dos soluciones madre y el medio que contiene luciferina necesitan ser protegidos de la luz. Coloque el tubo Falcon con luciferina-medio en una oscura cámara de calentamiento 36-37 ° C. En su caso, la luciferina también se pueden añadir directamente en las placas de cultivo en el momento del corte. Si no se añade la luciferina, no habrá ninguna reacción a la luz entre la luciferasa y luciferina y por lo tanto no hay ninguna señal de los tejidos. Después de la exposición UV, adjunte una hoja limpia en las vibratome. 3. SCN rebanar Procedimiento El siguiente procedimiento describe el corte de adultos, por lo general 2-4 meses de edad, C57/BL6 ratones. Tenga en cuenta: el procedimiento de corte, así como la exposición a la luz de los animales durante la noche, diferencial puede restablecer la fase de la SCN. Para evitar esto, la tala y el cultivo se debe realizar durante las horas de luz, preferiblemente entre ZT 06.12, cuando no hay cambios sustanciales de fase debido al procedimiento de ocurrir 12. Si SCN tiene que ser degustados en la oscuridad, 3.1 y 3.2 tienen que ser realizadas en el semáforo en rojo o con gafas de noche para evitar la luz inducida por los cambios de fase. Anestesiar el ratón de preferencia por isofluorano (Baxter) en un glass de la cámara. Cuando el animal ha perdido sus reflejos dolor (ver pellizcando con los clavos en la pata) pero aún no ha dejado de respirar (para mantener el suministro de oxígeno el mayor tiempo posible), rápidamente decapitar a la cabeza con un par de tijeras o similar. Tenga en cuenta: en algunos países de la exposición de CO 2 (hipercapnia) todavía se permite como método anestésico, aunque se ha informado a la promoción de la ansiedad de los animales. Además, la dislocación cervical puede ser necesaria antes de la decapitación. Por favor, siga las legislaciones locales, cuando la eutanasia de los animales. Quitar los ojos de la cabeza con unas tijeras a fin de evitar la tensión y la excitación adicional de los nervios ópticos, que pueden dañar el SCN. Si todavía conectado, extraiga la última vértebra cervical con una tijera, quitar la piel (Fig. 1a) y hacer dos cortes con un buen par de tijeras (por ejemplo tijeras iris), un corte a cada lado del cráneo a lo largo de los lados, lo que hace removible "tapa". Abrir el cráneo con una herramienta de micro gubia (tijeras de disección fina también se puede utilizar en un ratón) y eliminar todos los huesos hasta los bulbos olfativos se pueden ver. El trabajo nunca hacia arriba, presionando el cerebro con la herramienta, con el fin de prevenir el daño de la SCN ventral (Fig. 1B). Corte cuidadosamente el nervio óptico entre los bulbos olfatorios y hemisferios del uso de micro fina Tijeras de disección de primavera. Asegúrese de que el nervio se corta completamente ya que el estiramiento del nervio óptico puede conducir a daños en el SCN y las rodajas de ruptura. Gire la cabeza hacia abajo y dejar que el cerebro intacto caer (si todavía está conectado al cerebro, otros nervios craneales puede ser necesario cortar caudal al nervio óptico) en un recipiente (por ejemplo, un plato de Petri de vidrio ≈ 10 cm) llena de 50-100 ml de HBSS frío que permite un rápido enfriamiento del cerebro. Lo ideal sería que los dos nervios ópticos deben permanecer intactos (Fig. 1c). Mantener el cerebro en el HBSS 30-60 segundos para asegurarse de que el cerebro se enfría. Use una cuchara o similar y el lugar del cerebro frío, la superficie dorsal hacia arriba, sobre una superficie de corte estériles (por ejemplo, una tapa de vidrio una caja de petri al revés). Con el fin de preparar un corte coronal, hacer un corte perpendicular con hojas de afeitar estéril o bisturís entre los hemisferios cerebrales y el cerebelo, lo que elimina el cerebelo. Aplique pegamento en la plataforma seca que pertenecen a la vibroslicer / vibratome. Levante el cerebro (los hemisferios cerebrales, sin cerebelo y el bulbo olfatorio sin) mediante la inserción de una pinza fuerte y curvo en la parte rostral y Secar cuidadosamente el HBSS en un papel de filtro estéril, sin soltar el cerebro con las pinzas. (En lugar de insertar una pinza, un pequeño trozo de papel de filtro estéril puede ser usado para conectar y transferir el cerebro). Fijar los hemisferios en la plataforma pegada con la punta hacia arriba y la superficie ventral rostral más cerca de la cuchilla de corte. Coloque la plataforma en el soporte que pertenecen a la vibratome (por ejemplo, de Campden Instruments, Reino Unido) e inmediatamente se llenan de HBSS frío. Si el corte perpendicular se realiza correctamente, los hemisferios deben estar hacia arriba proporcionando así un buen ángulo necesario para hacer un corte coronal que contiene el SCN bilateral. Con el fin de llegar a la zona SCN objetivo, empezar a cortar las secciones más gruesas (500-800 micras) de los hemisferios a una velocidad alta o máxima de la vibratome. Traslado de la hoja puede ser bastante rápido en el comienzo antes de llegar al hipotálamo, pero debe ser reducida cuando el quiasma óptico se hace visible (alta frecuencia de vibración de la hoja y el movimiento lento horizontal disminuye el daño celular durante el corte, lo que aumenta la viabilidad de corte). Reducir las secciones de 100 m cuando el quiasma óptico se hace más grande (mayor) y la comisura anterior se hace más pequeño. Con el fin de adquirir una sección media SCN, el trabajo mismo "abajo" (dirección caudal) hasta los núcleos SCN dos comienzan a aparecer. Una lupa puede ser necesario para la visualización de los núcleos. Tenga en cuenta: el SCN en el cerebro del ratón se encuentra más caudal del quiasma óptico en comparación con el cerebro de la rata. Cuando el nivel deseado de SCN se ha alcanzado (el SCN se en este momento aparecen como más definido, las estructuras de forma redonda o de almendra, la figura 1d, aproximadamente Bregma-0.46–0.70 mm para la región centro del SCN en el ratón 13, Bregma – 0.92 hasta -1.40 mm para las ratas 14), cortar la sección SCN (Fig. 1e). Espesor adecuado del segmento es de 250 ± 50 ratón m; para la rata de 350 ± 50 micras. Con un cepillo suave, ascensor y la transferencia de la rebanada de SCN a una tapa de una placa de Petri de tamaño mediano lleno de HBSS frío, bajo un microscopio de disección o estereoscopio. Comprobar con una lupa si el SCN bilateral es claramente visible. Si la región media de la SCN será elegido (que no necesariamente puede ser el único nivel "óptimo" tajada, pero que consideramos que es la forma más fácil de estandarizar el procedimiento de cortar y reducir la variación), debe ser visto claramente por lo menos en un lado de lade sección. Si el corte es demasiado rostral, que otra sección y comprobar la SCN bajo la lupa. 4. Cultura SCN organotípicos En la tapa de la placa de Petri llena con HBSS, diseccionar el SCN bilateral como un tejido de cuadrados (alrededor de 1,5 mm a cada lado) con un par de bisturí estéril bajo un microscopio de disección. Un pequeño trozo del quiasma óptico se mantendrá unido al explante, pero no hay otros núcleos deberían ser incluidos. Corte lo más cerca posible sin la eliminación de tejido SCN. Si es apropiado para el experimento planeado, el SCN bilateral puede ser reducido a la mitad para obtener dos SCN unilateral. Una SCN unilateral puede ser utilizado como control (Figura 2a). Rellene 1200 L de la luciferina-medio en un ≈ 35 mm placa de Petri y colocar una membrana de la cultura (Milli-CM 0,4 micras, Millipore, Bedford, MA) en la parte superior de la superficie del líquido (2b). El volumen medio de cultivo es fundamental, ya que la membrana de la cultura debe sentarse de forma segura en la base de la placa de cultivo, no float o de la roca en el medio 11. Asegúrese de que no hay burbujas de aire debajo de la membrana. Evitar la exposición a la luz innecesaria cuando se trabaja con luciferina. Los explantes son pequeños y difíciles de recoger. Por lo tanto el uso de una pipeta 1.000 l + propina para succionar el explante SCN en la punta y presione sobre la membrana. En caso de que el explante es demasiado grande para caber fácilmente en una punta de 1.000 l pipeta (SCN por ejemplo, la rata y ratón SCN bilateral) de la punta se puede cortar con una herramienta estéril para crear una abertura más amplia. Deseche HBSS excesiva en la membrana con la pipeta. Para la grabación de la luciferasa, único lugar donde uno SCN / plato (Fig 2b), como los tubos de grabación de detectar todos los fotones emitidos por el plato y no distinguir entre las señales de diferentes tejidos. Selle el recipiente con una tapa de vidrio (≈ 40 mm, Menzel-Gläser, Alemania) y grasa de vacío (Dow Corning Corp., EE.UU.) 11. Asegúrese de que la junta esté bien apretado (Figura 2c). Si no, el sello con más grasa. Las placas en un 36-37 ° C opaca a la luz la cámara y empezar a PMT-grabaciones inmediatamente. 5. Medición de la actividad luciferasa por bioluminiscencia de grabación Luciferasa inducida por las señales de la bioluminiscencia de los tejidos SCN pequeños son detectados y amplificados con conjuntos de tubos photonmultiplier-detector (PMT) montado dentro de una cámara estanca a la luz. El PMT se colocan normalmente ~ 2.1 cm por encima del 8 placas de cultivo. PMT configuraciones de grabación puede ser por encargo o están disponibles en el 11. Coloque el plato en una PMT (el calor producido por el PMT se eliminará la condensación en la cubierta de cristal) y cerrar la cámara. Asegúrese de que la cámara es 100% a prueba de luz como la oscuridad de contar con PMT utiliza para los tejidos SCN es muy bajo (menos de 20 fotones / min). El PMT detectar hasta el más débil de la fuga de luz. Iniciar la adquisición de datos, que se realiza con el software (por ejemplo LumiCycle; Actimetrics Inc., Wilmette, Illinois, EE.UU.). Cuenta de fotones se integran en intervalos de 10-10 minutos para llegar de alta resolución de la expresión de genes / proteínas. Después de terminada la grabación, la expresión obtenida circadiano de los genes / proteínas pueden ser analizados con el software adecuado (Origen, OriginLab, Northampton, MA, EE.UU.; ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc, Chrono, Till Roenneberg de la Universidad de Munich, Munich, Alemania) para determinar la etapa, período (tiempo de un ciclo) y la amplitud del ritmo. La máxima expresión del gen o la proteína se utiliza sobre todo como punto de referencia y se define como el más alto número de fotones durante un ciclo. Los datos pueden ser suavizadas antes de los análisis de la fase, periodo y la amplitud, sobre todo si la relación señal / ruido es bajo. La línea de base a veces cambia y hay que resta antes de los análisis se llevan a cabo. 6. Los resultados representativos: Presentamos aquí la PER2 oscilatorio:: expresión LUC como lectura para la viabilidad y las condiciones del cultivo de tejidos. Bajo condiciones óptimas, y si el tejido está vivo, el PER2:: expresión LUC oscila con un ritmo circadiano, como se muestra en la figura 3. PER2 en el SCN es la máxima expresada por lo general alrededor de Tiempo Zeitgeber 12-13 (ZT donde 12 representa las luces apagadas en 12:12 h luz: oscuridad ciclo). El de mayor tamaño del tejido vivo, mayor es el número de fotones se convierte. Sin embargo, el tamaño y el grosor del tejido organotypically cultivadas deben mantenerse pequeños con el fin de mantener el tejido viable, de preferencia no más de 15 mm 2 11 y no más gruesa de 500 m 7. El SCN, si disecados como se describe aquí, por lo general muestra el recuento de fotones entre 10.000-40.000/min si el tejido proviene de una homocigotos PER2:: animal LUC. La amplitud de la oscilación en las culturas SCN organotípicos suele ser muy alto durante el primer ciclo, en comparación con los ciclos siguientes. No está del todo claro por qué el primer ciclo tiene una muy alta amplitude. Una posible explicación es que una parte sustancial de las células en el tejido pueden morir poco después del corte inicial y el cultivo, por lo tanto no utilizar luciferina después del primer ciclo. El procedimiento de corte también puede causar excitación excesiva, lo que podría amplificar la señal de luciferasa en el primer ciclo. La Figura 3 muestra las huellas de luminiscencia de las lonjas de SCN y contiene una traza (rojo) obtenidos a partir de un sector que no estaba inicialmente sanas. Tejidos muertos o insalubres tienen un bajo recuento de fotones líneas de base. (Además, los tejidos muertos a menudo se disocian en el plato y no se puede quitar de la membrana de una sola pieza.) La técnica descrita en este informe beneficiosa puede ser utilizado en experimentos farmacológicos. La Figura 4 muestra una huella de una cultura que hemos tratado entre los días 1 y 2 con un bloqueador del canal de HCN (ZD7288, 10 M). Como se puede observar en la figura y como publicó anteriormente con el 15, el bloqueador redujo significativamente la amplitud de la oscilación circadiana de PER2, sin embargo, después del lavado con medio de cultivo normal de la oscilación volvió, lo que demuestra que el bloqueador de afectados del reloj molecular, pero la tejido era viable y saludable. Figura 1. Corte de procedimiento A) La cabeza decapitada de un ratón de la eutanasia con los ojos y la piel extirpada. B) El cráneo es removido con una herramienta de micro gubia. Al usar la herramienta, se debe trabajar hacia arriba y no presionar el cerebro con la herramienta. C) El cerebro se muestra al revés (lado ventral), sin bulbos olfatorios. El quiasma óptico blanco con los dos nervios ópticos intactos se pueden ver. El núcleo supraquiasmático (SCN, las fronteras marcadas en rojo) se encuentra cerca del quiasma óptico. D) Un cerebro coronal corte unido a la plataforma en la vibroslicer, en el ámbito de la NCS. E) Sección coronal del cerebro (250 m de espesor) que contiene el quiasma óptico (CO), el tercer ventrículo (3V) y los núcleos bilateral supraquiasmático (NSQ). Figura 2. Cultivo de tejidos organotípicos. A) Los dos núcleos SCN unilateral (insertar) disecados de la corte se muestra. B) placa de cultivo (35 mm placa de Petri) con la membrana de la cultura, el medio y explante, pero sin grasa de vacío y tapa de vidrio. El medio (1,2 ml) puede ser visto como líquido entre el plato y la membrana. Un núcleo SCN unilateral se coloca en la membrana de la cultura. El blanco más parte del tejido del pequeño es un pedazo del quiasma óptico (insertar). C) La placa de cultivo con su membrana y el tejido SCN, sellado con grasa de vacío y una cubierta de vidrio redondo. Figura 3. Grabaciones de la bioluminiscencia de cultivo de tejidos sanos y no sanos-SCN. Ejemplos de las grabaciones de la bioluminiscencia de período2:: luciferasa (PER2:: LUC) expresión en el núcleo supraquiasmático (NSQ) rebanadas obtenidas de ratones a cabo en un 12 h: 12 h luz: oscuridad ciclo. El PER2:: LUC proteína oscila con un ritmo circadiano (~ 24 horas) la variación en el que la máxima expresión de la proteína se produce en el momento Zeitgeber 12-13. Por lo tanto, la fase del ritmo de genes depende del horario de la luz oscura en la que se mantuvo al animal sacrificado antes. Por lo general, la bioluminiscencia de los tejidos del SCN unilaterales disecados como se describe en el protocolo muestra el recuento de fotones entre ~ 10.000-40.000/minute. La figura muestra las huellas de una cultura saludable SCN (negro), una organización no-cultura saludable SCN (rojo) y una cultura de SCN que se secó (azul) después de abrir la caja de cultivo sellada en el día 4 y no volver a sellar el plato correctamente ( indicado por la flecha). Figura 4. Bioluminiscencia de grabación durante y después de la exposición al fármaco. PER2:: LUC expresión de una cultura antes, durante y después de la acción de un bloqueador de canal de HCN (ZD7288, 10 M). La primera flecha indica el momento en que el bloqueo se añadió. La segunda flecha indica lavado, que se hizo mediante la sustitución de la droga que contienen medio con un medio de control acondicionado. Tenga en cuenta la amplitud reducida después de 2 días de exposición a las drogas, la falta de oscilación en el día 4 y la rápida recuperación del ritmo de proteína después de lavado.