Порядок подготовки ломтиками содержащие взрослой мыши супрахиазматическое ядро гипоталамуса (SCN), и быстрый путь к культуре SCN ткани в органотипической состояние культуры, как сообщается. Кроме того, измерения колебательных часы ген экспрессии белка с использованием динамических люциферазы технология описана репортером.
Центральных циркадных (~ 24 ч) часы координации суточные ритмы в физиологии и поведения находится в супрахиазматического ядра (SCN), расположенные в переднем гипоталамусе. Часы напрямую синхронизируется свет через сетчатку и зрительный нерв. Суточный колебания генерируются при взаимодействии отрицательных обратных связей из числа так называемых "часовых генов", и их белковых продуктов, включая период (Per) генов. Частота ядра зависит также от деполяризацию мембраны, кальция и цАМФ 1. SCN шоу ежедневно колебаний в часы экспрессии генов, метаболической активности и спонтанной электрической активности. Примечательно, что это эндогенной активности циклических сохраняется во взрослом ломтиками ткани SCN 2-4. Таким образом, биологические часы могут быть легко изучены в лабораторных условиях, позволяющих молекулярном, электрофизиологические и метаболические исследования кардиостимулятора функции.
SCN является небольшой, четко определенных двусторонних сооружения, расположенного прямо над зрительных нервов 5. В крысы он содержит ~ 8,000 нейронов в каждом ядре и имеет размеры приблизительно 947 мкм (длина, rostrocaudal оси) х 424 мкм (ширина) х 390 мкм (высота) 6. Чтобы вскрыть из SCN необходимо вырезать мозг срез определенного уровня мозга, где SCN могут быть идентифицированы. Здесь мы описываем рассекает и нарезая процедуры сюжетные программы, которая одинакова для мышей и крыс мозги. Кроме того, мы покажем, как культура расчлененный ткани organotypically на мембрану 7, методика, разработанная для SCN культуре ткани Yamazaki и соавт. 8. Наконец, мы показали, как трансгенной ткани могут быть использованы для измерения выражение часовых генов / белков с использованием динамических люциферазы технологии репортер, метод, который первоначально был использован для измерения циркадных Geusz и соавт. 9. Мы здесь, используют SCN ткани от трансгенных нокаут в период2:: люциферазы мышей производства Ю и др. 10.. Мышей содержат белок слияния периода (PER) 2 и люциферазы светлячка фермента. Когда PER2 переводится в присутствии субстрата для люциферазы, т.е. люциферин, PER2 выражение можно наблюдать, как при биолюминесценции люциферазы катализирует окисление люциферин. Число излученных фотонов положительно коррелирует с количеством производится PER2 белка и биолюминесценции ритмы матча PER2 ритм белка в естественных условиях 10. Таким образом, циклическое изменение PER2 выражение может находиться под постоянным контролем в режиме реального времени в течение многих дней. Протокол мы следуем для культивирования тканей и в режиме реального времени биолюминесценции запись была тщательно описывается Ямазаки и Такахаси 11.
Преимущества и недостатки технологии репортер люциферазы
В отличие от бывшего методы естественных условиях, например, RT-PCR, на месте гибридизации и иммуноблоттинга, которые требуют отбор проб ткани в разных точках времени (предоставление низком разрешении время обычно 2-4 часа в зависимости от частоты дискретизации) с целью изучения суточной вариации гена и белка выражения, люциферазы технологии репортер позволяет с высоким разрешением (1-10 мин) изучение циркадных колебаний в течение многих дней в том же препарате. Таким образом, число используемых животных сведена к минимуму и детальные исследования влияния на фазу и период ритма возможности, которые обычно не представляется возможным с использованием обычных методов отбора проб с низким временным разрешением. Однако, несмотря на относительные измерения амплитуды ритма возможно, следует подчеркнуть, что репортер технологии не количественные и поэтому не могут быть использованы для измерения количества транскрипции генов или переведены белков.
Ткани записи может быть запущен и проанализированы сразу после культивирования, большое преимущество для непосредственного изучения молекулярных эффектов в естественных условиях стресса, в естественных условиях светоиндуцированного фазовые сдвиги и т.д. органотипической культуры SCN позволяет длительно (недели) фармакологических манипуляций взрослого мозга ткани, содержащей нетронутыми зрелый синаптической сети и технологии репортер люциферазы позволяет стабильной записи в течение многих недель. Таким образом, ткань не должна быть новорожденных или раннем послеродовом для получения здорового культур, и в отличие от острого хронического часть фармакологического лечения может быть выполнена. В отличие от плазмид-репортер трансфекции в клеточных культурах, которые не приводят к включению ДНК в геноме трансгенных люциферазы-моделях на животных (а также Lenti-вирус трансфекции) благоприятны, если эпигенетические изменения должны быть изучены. Следует в этом контексте также отметить, что свечение изображения в наше время можно с высокочувствительной ПЗС-камер 11, что позволяет даже в записи отдельных нейронов SCN (~ 6-10 мкм) и другие типы клеток, используемых крупными лабораториями изучение циркадных ритмов. Наконец, несколько циркадных следователи обычно используют мониторинг молекулярного выражение с помощью других журналистов, например, зеленого флуоресцентного белка, с целью изучения генов часы / белка колебаний 16-19.
Аспекты толщина среза
Здесь рекомендуется толщина среза SCN (200-300 мкм) может быть уменьшен или увеличен по желанию. Однако, несмотря на ткани выравнивается на мембране через несколько дней в культуре, это не рекомендуется превышать 500 мкм, толщина сначала вырезать часть, чтобы сохранить жизнеспособность тканей 7. Ломтик тоньше, чем 100 мкм механической и практическим причинам трудно справиться. Потому что SCN ткани неоднородна толщина среза может повлиять на фазе люциферазы выходной сигнал, так как различные регионы внутри SCN (например, "ядро" против "оболочки", и спинной сравнению с вентральной области) колеблются с различными фазами 20 и дифференциально повторную синхронизацию после фазы 21. Толщина среза также влияет на базовые фотонов подсчет, так как больше ткани излучает большее количество фотонов. Амплитуда молекулярных колебаний может, таким образом, косвенно влиять размер эксплантов. По этим причинам, контроля и обработанных культурах всегда должен быть того же размера, толщины и содержащую же области SCN для того, чтобы колебаться в одинаковой фазе и с одинаковой амплитудой. Две односторонние ядер, с другой стороны, колеблются в фазе друг с другом и с аналогичными амплитуд тех пор, пока vibratome разрез горизонтальной, а не угловой (который, в свою очередь зависит от этого разделения разрез между мозжечком и двух полушарий перпендикулярно к поверхности стола). Следователь, который выполняет SCN культивирования могут возникнуть, что SCN культуры не колеблются в фазе друг с другом. Практика и стандартизация нарезки техники, то есть ломтики всегда срезают в то же rostro-каудальном уровне SCN, улучшит результат.
Критические шаги
Возможные изменения
Значение
В трансгенных мышей и крыс штаммов (mPER2:: LUC; mPer1-Люк 8, 10, 27), активность люциферазы фермента отражает белка или ритмы экспрессию генов и могут быть оценены по биолюминесценции записи. Люциферазы генерируемых биолюминесценции дает слабый сигнал, но фон свечения близка к нулю, что делает этот метод выгодно. Более того, поскольку люциферазы молекула неустойчива и быстро деградирует нет телототоксичность, которые могут появиться при длительном освещении возбуждающим 28. Взятые вместе, эти свойства позволяют длительное экспериментов делает люциферазы технологии репортер весьма выгодным в циркадных исследований.
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при финансовой поддержке Шведского медицинского исследовательского совета (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; основы Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Марта Лундквист и Сигурд оч Эльза Goljes Минне, а также шведского общества медицины SLS-95151. Профессор Гена Д. Блок, Лос-Анджелесе, является благодарностью за ценные замечания по рукописи. Мы благодарим д-р Майкл Andäng и д-ра Елены Johard для блокатор канала HCN, и профессор Абдель Эль-Manira для предоставления видео-микроскоп.
Этические соображения:
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Каролинского института и "Стокгольм Norra Djurförsöksetiska Nämnd". Все эксперименты на животных проводятся с целью свести к минимуму любые возможные стресс или неудобства для животных.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
B27 supplement 50x | Invitrogen/Gibco | 17504-044 | ||
Cover glasses | Menzel-Gläser | 40#1 | ≈ 40 mm | |
Culture membranes | Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm | |
DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma | D2902 | Powder for 1L | |
Filter paper | Whatman | 1003 055 | ≈ 55 mm | |
Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μm Polyethersulfone | |
Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 | |
HEPES | Invitrogen/Gibco | 15630-056 | 100 ml | |
HBSS 10x | Invitrogen/Gibco | 14065-049 | 500 ml | |
NaOCH3 7.5% | Invitrogen/Gibco | 25080-060 | 50 ml | |
Luciferin | Promega | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt | |
Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | ||
PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | 100 ml | |
Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm | |
PMT | Hamamatsu | H9319-11MOD | ||
Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 | |
Vacuum filter | Fisher | 09-761-5 | ||
Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | ||
Vibratome | Campden Instruments |