Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico

1. Soluzione di preparazione Terreno di coltura di aria capacità tampone Riempire una bottiglia da 1 litro, con circa 800 ml sterile H 2 O (in autoclave MilliQ H 2 O). Mescolando, aggiungere e mescolare seguenti sostanze: 1 glucosio contenitore, privo di siero in polvere 2902 DMEM senza bicarbonato di sodio e rosso fenolo (rosso fenolo interferisce con il segnale di bioluminescenza), 20 mL B27 supplemento 50x, 4,7 ml di un 7,5% NaHCO 3 soluzione (o 0,35 g di NaHCO 3), 10 HEPES ml 1M, 2,5 ml PenStrep 10.000 U / mL e 3,5 g di D-glucosio. Lasciate che i media mescolare fino a quando gli ingredienti sono completamente sciolti. La media finale (1 litro) conterrà: DMEM 1x, 1x B27 supplemento, 4,2 mM NaHCO 3, 10 HEPES mm, 25 U / mL di penicillina, 25 U / mL di streptomicina e 19 mM D-glucosio. Regolare il pH a 7,2, usando NaOH HCl per diminuire o aumentare il pH, e portare il volume fino a 1 litro con sterili H 2 O. Regolare osmolalità con H 2 O (osmolalità diminuzione) o D-glucosio (osmolalità aumento). L'osmolalità deve essere compresa tra 285-315 mOsm / Kg, ma il range ottimale è 300-310 mOsm / Kg. Non per diluire il medium più del 5%. Filtrare il brodo di coltura sterile utilizzando Corning set di filtrazione sotto vuoto (ad esempio 2 x 500 ml con dimensione dei pori 0,22 micron) in una cappa sterile. Mantenere il mezzo in 4 ° C e proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. Si raccomanda che il mezzo venga utilizzato entro 3 mesi. Hank soluzione salina bilanciata (HBSS) buffer con i supplementi (per le sezioni di taglio) Riempire una bottiglia da 1 litro in vetro con ~ 600 mL sterili (autoclavato MilliQ) H 2 O e aggiungere le seguenti sostanze: 100 ml di brodo HBSS 10x, 10 ml di penicillina-streptomicina 10.000 U / mL, 5 mL di un 7,5% NaHCO 3 soluzione e 10 ml HEPES 1M. La soluzione di taglio finale conterrà: 1x HBSS, 10 HEPES mM, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / ml penicillina e 100 U / mL di streptomicina. Controllare il pH e, se necessario, aggiustare il pH a 7.2 e portare il volume fino a 1 litro con sterili H 2 O. Controllare osmolalità, che deve essere compreso tra 285-315 mOsm / Kg. Raffreddare la HBSS a 4 ° C. Il buffer HBSS deve essere molto freddo (4 ° C) durante le operazioni di affettamento / taglio procedura al fine di abbattere il metabolismo e preservare la vitalità dei tessuti. 2. Preparativi Prima di fette di taglio e coltura I tessuti sono coltivate in una camera calda e asciutta, senza CO 2. Per evitare di seccare la cultura devono essere sigillati con gli occhiali di accompagnamento allegata al piatti di grasso. A tal fine, compilare 5 siringhe mL con silicone a base di grasso per vuoto. Coprire le punte siringa con piccoli pezzi di carta stagnola e autoclave loro. Inoltre, autoclave filtro carta (usato durante taglio procedura). A destra prima di tagliare procedura, applicare grasso in autoclave a vuoto sulla superficie anello superiore di 35 millimetri piatti di Petri. Preparare un piatto a parte Petri per ogni cultura fetta. Prima di avviare procedura di affettare tutti gli strumenti non sterili, lame di rasoio, lame vibratome, vetri di copertura e altro materiale utilizzato per la procedura di fetta e la cultura devono essere sterilizzati. Spray tutti non sterili con il 70% di etanolo. Esporre gli strumenti e le piastre di Petri unta con UV in una cappa sterile per almeno 30 minuti di esposizione ai raggi UV prima coltura. Allo stesso tempo, riempire un tubo Falcon con l'aria-buffering terreno di coltura (conta 1,2 mL per ogni cultura; per 8 culture prepararsi per esempio, 10 ml di mezzo) e aggiungere appena scongelato luciferina (0,1 M soluzione madre, Promega, Madison, WI) (10 luciferina microlitri a 10 ml di mezzo; concentrazione finale di 0,1 mm). La luciferina è sensibile alla luce e sia soluzioni madre e la luciferina mezzo contenente bisogno di essere protetti dalla luce. Posizionare il tubo Falcon con luciferina-media in un buio 36-37 ° C il riscaldamento della camera. Se del caso, la luciferina possono anche essere aggiunti direttamente nei piatti cultura al momento del taglio. Se luciferina non viene aggiunto, non ci sarà nessuna reazione luce tra luciferasi e luciferina, e quindi nessun segnale dal tessuto. Dopo l'esposizione ai raggi UV, allegare una lama sterile al vibratome. 3. SCN Slicing procedura La procedura seguente descrive taglio di adulto, di solito 2-4 mesi, C57/BL6 topi. Si prega di notare: la procedura di taglio, così come l'esposizione alla luce degli animali durante la notte, possono azzerare il differenziale fase del SCN. Per evitare questo, il taglio e la coltura deve essere effettuata durante le ore di luce, preferibilmente tra ZT 6-12, in assenza di sostanziali cambiamenti di fase a causa della procedura di verifica 12. Se SCN è da campionare nelle tenebre, 3.1 e 3.2 devono essere eseguite in luce rossa o con occhiali di notte per evitare la luce indotto spostamenti di fase. Anestetizzare il mouse preferibilmente con isofluorane (Baxter) in una GLAss da camera. Quando l'animale ha perso il suo dolore riflessi (controllo pizzicando con le unghie nella zampa), ma non ha ancora smesso di respirare (per mantenere la fornitura di ossigeno più a lungo possibile), rapidamente decapitare la testa con un paio di forbici o simili. Attenzione: in alcuni paesi CO 2 di esposizione (ipercapnia) è ancora consentito come metodo anestetico, anche se è stato segnalato per promuovere l'ansia animale. Inoltre, la dislocazione cervicale può essere richiesto prima di decapitazione. Si prega di seguire legislazioni locali quando eutanasia degli animali. Togliere gli occhi dalla testa con le forbici al fine di prevenire ulteriore tensione e l'eccitazione dei nervi ottici, che possono danneggiare il SCN. Se ancora attaccato, rimuovere il vertebrato ultimi cervicale con le forbici, togliere la pelle (Fig. 1a) e fare due tagli, con un bel paio di forbici (per esempio forbici iris), una tagliata su ogni lato del cranio lungo i lati, rendendo così removibile "coperchio". Aprire il cranio con uno strumento micro pinza ossivora (fine forbici dissezione può essere utilizzato anche su un mouse) e rimuovere tutte le ossa fino a quando il bulbo olfattivo può essere visto. Verso l'alto lavoro mai, premendo il cervello con lo strumento, al fine di evitare danni del SCN ventrale (Fig. 1b). Tagliare con cautela il nervo ottico tra i bulbi olfattivi ed emisferi utilizzando micro multa dissezione forbici primavera. Assicurarsi che il nervo sia completamente eliminati dal stiramento del nervo ottico può causare danni al SCN e fette di rottura. Girare la testa a testa in giù e lasciare che il cervello intatto cadere (se ancora attaccato al cervello, altri nervi cranici potrebbe essere necessario tagliare caudale del nervo ottico) in un contenitore (per esempio un piatto di vetro Petri ≈ 10 cm) riempito con 50-100 ml HBSS freddo che permette un rapido raffreddamento del cervello. Idealmente, i due nervi ottici dovrebbe rimanere intatto (Fig. 1c). Tenere il cervello in HBSS 30-60 secondi per assicurarsi che il cervello è raffreddato. Utilizzare un cucchiaio o simili e luogo del cervello refrigerati, superficie dorsale alto, su una superficie di taglio sterile (ad esempio un piatto di vetro Petri coperchio capovolto). Al fine di preparare un taglio coronale, fare un taglio perpendicolare con lame di rasoio sterile o bisturi tra gli emisferi cerebrali e il cervelletto, eliminando in tal modo il cervelletto. Applicare supercolla sulla piattaforma asciutta appartenenti alla vibroslicer / vibratome. Sollevare il cervello (emisferi cerebrali senza cervelletto e senza bulbi olfattivi) con l'inserimento di un forte, pinze curve nella parte rostrale e asciugare con cura le HBSS su una carta filtro sterile, sempre tenendo il cervello con le pinze. (Invece di inserire una pinza, un piccolo pezzo di carta da filtro sterile può essere utilizzato per collegare e trasferire il cervello). Fissare il emisferi sulla piattaforma incollato con la punta verso l'alto rostrale e la superficie ventrale più vicina alla lama di taglio. Fissare la piattaforma nel supporto appartenenti alla vibratome (per esempio da Campden Instruments, UK) e subito si riempiono di HBSS freddo. Se il taglio perpendicolare è fatto correttamente, il emisferi dovrebbe stare verso l'alto offrendo così un buon angolo necessario per fare un taglio coronale contenente il SCN bilaterali. Al fine di raggiungere la zona SCN bersaglio, inizia tagliando sezioni più spesse (500-800 micron) degli emisferi ad alta velocità o al massimo del vibratome. Spostando la lama può essere abbastanza veloce all'inizio prima di raggiungere l'ipotalamo, ma deve essere rallentato quando il chiasma ottico diventa visibile (ad alta frequenza della lama vibrante e lento movimento orizzontale diminuisce i danni delle cellule durante il taglio, aumentando così la vitalità fetta). Ridurre le sezioni da 100 micron quando il chiasma ottico diventa più grande (più ampio) e la commissura anteriore diventa più piccolo. Al fine di acquisire un mid-SCN sezione lavoro da soli "giù" (direzione caudale) fino a quando i due nuclei SCN iniziano a comparire. Una lente di ingrandimento può essere necessario per visualizzare i nuclei. Attenzione: il SCN nel cervello del mouse si trova più caudale del chiasma ottico rispetto al cervello di ratto. Quando il livello desiderato di SCN è stato raggiunto (il SCN sarà a questo punto appaiono come più definito, le strutture a forma rotonda o mandorla; Fig. 1d, circa bregma-0,46–0,70 mm per la regione centro di SCN nel topo 13, bregma – ,92–1,40 mm per ratto 14), tagliare la sezione SCN (Fig. 1e). Adeguato spessore della fetta è per il topo 250 ± 50 micron; per topo 350 ± 50 micron. Con una spazzola morbida, sollevare e trasferire la fetta SCN di un coperchio da un piatto di medie dimensioni Petri riempite con HBSS freddo, posta sotto un microscopio dissezione o stereoscopio. Controllare sotto ingrandimento se il SCN bilaterale è chiaramente visibile. Se la metà del territorio del SCN saranno scelti (che non necessariamente l'unico livello "ottimale" fetta, ma che riteniamo sia il modo più semplice per standardizzare la procedura di affettamento e ridurre le variazioni), deve essere chiaramente visto almeno su un lato delsezione. Se il taglio è stato troppo rostrale, fare un'altra sezione e controllare il SCN sotto ingrandimento. 4. SCN Cultura organotipica Nel coperchio capsula di Petri riempite con HBSS, sezionare il SCN bilaterali come un tessuto quadrato (~ 1,5 millimetri per lato) con un paio di bisturi sterili sotto un microscopio da dissezione. Un piccolo pezzo del chiasma ottico rimane attaccato al espianto, ma non altri nuclei dovrebbero essere inclusi. Tagliare il più vicino possibile senza rimuovere il tessuto SCN. Se del caso per l'esperimento previsto, il SCN bilaterali possono poi essere tagliati a metà per ottenere due SCN unilaterale. Un SCN unilaterale può essere quindi utilizzato come controllo (Fig. 2a). Riempire 1200 microlitri della luciferina-medio in un piatto ≈ 35 millimetri Petri e il luogo di una membrana cultura (Milli-CM 0,4 micron, Millipore, Bedford, MA) in cima alla superficie liquida (2b). Il volume del terreno di coltura è fondamentale, come la membrana cultura dovrebbe sedersi in modo sicuro alla base del piatto cultura, non galleggiare o roccia nel mezzo 11. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria sotto la membrana. Evitare l'esposizione non necessaria alla luce quando si lavora con luciferina. Il espianti sono piccoli e difficili da raccogliere. Quindi usare un 1000 + pipetta microlitri punta a succhiare l'espianto SCN nella punta e premerlo sulla membrana. Nel caso in cui espianto è troppo grande per adattarsi facilmente in una punta di 1000 ml pipetta (es. ratto SCN; e SCN del mouse bilaterali), la punta può essere tagliato con uno strumento sterile per creare un'apertura più ampia. Scartare HBSS eccessiva sulla membrana con la pipetta. Per la registrazione luciferasi, inserire una sola SCN / piatto (Figura 2b), come i tubi di registrazione rilevare tutti i fotoni emessi dal piatto e non distinguono tra i segnali provenienti da diversi tessuti. Sigillare il piatto con un bicchiere di copertura (≈ 40 mm, Menzel-Glaser, Germania) e grasso per vuoto (Dow Corning Corporation, USA) 11. Assicurarsi che il sigillo è stretta (Fig. 2c). In caso contrario, sigillare con più grasso. Trasferire le piastre a 36-37 A ° C a tenuta di luce della camera e iniziare PMT-registrazioni immediatamente. 5. Misurazione di attività luciferasi da bioluminescenza di registrazione Luciferasi segnali bioluminescenza indotta dal tessuto SCN piccoli vengono rilevati e amplificati con photonmultiplier-tube (PMT) assemblee rilevatore montato all'interno di una camera di luce stretto. I PMT sono normalmente posizionati ~ 1-2 cm sopra i piatti della cultura 8. Impostazioni di registrazione PMT può essere personalizzato o sono disponibili in commercio 11. Porre la capsula con un PMT (il calore prodotto dal PMT rimuoverà condensa sul vetro di copertura) e chiudere la camera. Assicurarsi che la camera è al 100% a tenuta di luce come il numero oscuro della PMT utilizzato per tessuti SCN è molto bassa (meno di 20 fotoni / min). La PMT rilevare anche la dispersione di luce più deboli. Avviare l'acquisizione dati, che viene effettuata con il software (per esempio LumiCycle; Actimetrics Inc., Wilmette, IL, USA). Conta fotoni sono integrati su intervalli 1-10 min per ottenere alta risoluzione del gene / proteina espressione. Dopo la registrazione è finita, l'espressione ottenuta circadiano del gene / proteina possono essere analizzati con il software appropriato (Origine, OriginLab, Northampton, MA, USA; ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc; Crono, Till Roenneberg, Università di Monaco di Baviera, Monaco, Germania) per determinare fase, periodo (tempo per un ciclo) e l'ampiezza del ritmo. L'espressione di punta del gene o della proteina è in gran parte utilizzato come punto di riferimento ed è definito come il più alto numero di fotoni durante un ciclo. I dati possono essere smussati prima analisi di fase, periodo e ampiezza, soprattutto se il rapporto segnale / rumore è basso. La linea di base a volte modifiche e devono essere sottratto prima le analisi vengono eseguite. 6. Rappresentante dei risultati: Noi qui presenti il ​​PER2 oscillatorio:: LUC espressione come leggere per la vitalità e la condizione del tessuto coltura. In condizioni ottimali, e se il tessuto è vivo, il PER2:: LUC espressione oscilla con un ritmo circadiano, come illustrato in figura 3. PER2 nel SCN è massimamente espresso tipicamente intorno Tempo zeitgeber 12-13 (dove ZT 12 rappresenta luci spente in un hr 12:12 luce: buio ciclo). Le dimensioni più grandi del tessuto vivo è, maggiore è il numero di fotoni diventa. Tuttavia, la dimensione e lo spessore del tessuto organotypically colta dovrebbe essere tenuto piccolo in modo da mantenere i tessuti vitali, preferibilmente non superiore a 15 mm 2 11 e non più spesse di 500 micron 7. Il SCN, se sezionato come descritto qui, mostra tipicamente conta fotone tra 10.000-40.000/min se il tessuto viene campionata da un omozigote PER2:: LUC animale. L'ampiezza dell'oscillazione nelle culture SCN organotipica è in genere molto elevato durante il primo ciclo in confronto con i cicli successivi. Non è del tutto chiaro perché il primo ciclo ha amplit molto altaUde. Una possibile spiegazione è che una parte sostanziale delle cellule nel tessuto può morire poco dopo il taglio iniziale e coltura, quindi non utilizzando luciferina dopo il primo ciclo. La procedura di taglio può anche causare eccitazione eccessiva che potrebbe amplificare il segnale luciferasi durante il primo ciclo. La figura 3 mostra le tracce luminescenza da fette di SCN e contiene una traccia (rosso) ottenuto da una fetta che non era inizialmente sana. Tessuti morti o insalubri sono linee di base a basso numero di fotoni. (In aggiunta, i tessuti morti spesso si dissociano nel piatto e non può essere rimosso dalla membrana in un unico pezzo). La tecnica descritta in questo rapporto può vantaggiosamente essere utilizzato negli esperimenti farmacologici. La Figura 4 mostra una traccia da una cultura che abbiamo trattato tra il giorno 1 e 2 con un bloccante dei canali HCN (ZD7288, 10 mM). Come si può vedere nella figura e come pubblicato in precedenza 15, il blocco ha ridotto significativamente l'ampiezza dell'oscillazione circadiana del PER2, tuttavia, dopo il lavaggio con terreno di coltura normale l'oscillazione è tornato, a dimostrazione che il blocco colpito l'orologio molecolare, ma il tessuto è stato vitale e sano. Figura 1. Affettare procedura A) La testa di un topo eutanasia decapitato con gli occhi e la pelle rimossa. B) Il cranio è stato rimosso con uno strumento di micro pinza ossivora. Quando si utilizza lo strumento, è necessario lavorare verso l'alto e mai premere il cervello con lo strumento. C) Il cervello mostrato a testa in giù (fino lato ventrale) senza bulbi olfattivi. Il chiasma ottico bianca con i due nervi ottici intatto può essere visto. Il nucleo soprachiasmatico (SCN, i confini segnati in rosso) si trova nei pressi del chiasma ottico. D) Un cervello coronale taglio solidale alla piattaforma nel vibroslicer, a livello di SCN. E) sezione coronale del cervello (250 micron di spessore) contenente il chiasma ottico (OC), terzo ventricolo (3V) ed i nuclei bilaterali soprachiasmatico (SCN). Figura 2. Tessuto coltura organotipica. A) I due nuclei SCN unilaterale (inserto) sezionato dalla fetta mostrato. B) piatto Cultura (35 mm Petri) con membrana cultura, media e espianto, ma senza grasso per vuoto e il vetro di copertura. Il mezzo (1,2 ml) può essere visto come liquido tra il piatto e la membrana. Un nucleo SCN unilaterale è posto sulla membrana cultura. Il bianco più parte del tessuto è un piccolo pezzo del chiasma ottico (inserto). C) Il piatto cultura con la sua membrana e il suo tessuto SCN, sigillato con grasso per vuoto e un bicchiere di copertura rotondo. Figura 3. Registrazioni bioluminescenza da culture SCN sano e non sano del tessuto. Esempi di registrazioni di bioluminescenza PERIOD2:: luciferasi (PER2:: LUC) espressione nel nucleo soprachiasmatico (SCN) fettine ottenute da topi tenuto in una 12h: 12h luce: buio ciclo. La PER2:: LUC proteine ​​oscilla con un ritmo circadiano (~ 24 ore), variazione, in cui la massima espressione della proteina si verifica in fase zeitgeber 12-13. Quindi, la fase del ritmo gene dipende dal programma chiaro scuro in cui è stato tenuto l'animale prima sacrificato. Tipicamente, la bioluminescenza dai tessuti SCN unilaterale sezionato come descritto nel protocollo mostra conta tra fotone ~ 10.000-40.000/minute. La figura mostra le tracce da un sano (nero) cultura SCN, una non sana cultura SCN (rosso) e una cultura che SCN asciugata (blu) dopo l'apertura il piatto sigillato cultura al giorno 4 e non ri-sigillare il piatto correttamente ( indicata dalla freccia). Figura 4. Registrazione bioluminescenza durante e dopo l'esposizione al farmaco. PER2:: LUC espressione in una cultura prima, durante e dopo l'azione di un bloccante dei canali HCN (ZD7288, 10 mM). La prima freccia indica il momento in cui il blocco è stato aggiunto. La seconda freccia indica washout, che è stato fatto sostituendo il farmaco contenente medio con mezzo di controllo condizionata. Si noti l'ampiezza ridotta dopo 2 giorni di esposizione al farmaco, la mancanza di oscillazione al giorno 4 e il recupero rapido del ritmo proteina dopo washout.