स्लाइस तैयार, Organotypic ऊतक संवर्धन और घड़ी जीन गतिविधि के suprachiasmatic नाभिक में luciferase रिकॉर्डिंग
Summary
तैयारी वयस्क माउस hypothalamic suprachiasmatic (SCN) नाभिक, और संस्कृति के लिए एक तेजी से रास्ता organotypic संस्कृति हालत में SCN ऊतक युक्त स्लाइस की प्रक्रिया रिपोर्ट कर रहे हैं. इसके अलावा, oscillatory घड़ी जीन प्रोटीन गतिशील luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी का उपयोग कर अभिव्यक्ति की माप वर्णित है.
Abstract
A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called “clock genes” and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 μm (length, rostrocaudal axis) x 424 μm (width) x 390 μm (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.
Protocol
Discussion
Luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी के साथ लाभ और नुकसान
RT-पीसीआर के रूप में पूर्व vivo तरीकों,, स्वस्थानी संकरण और पश्चिमी धब्बा है कि कई अलग अलग समय अंक (सामान्य 2-4 बजे के नमूना आवृत्ति के आधार पर एक कम समय संकल्प देने) में ऊतक के नमूने की आवश्यकता है क्रम में प्रतिदिन अध्ययन के विपरीत जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति में बदलाव, luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी उच्च (1-10 मिनट) संकल्प ही तैयारी में कई दिनों के लिए circadian दोलनों के अध्ययन की अनुमति देता है. चरण और ताल की अवधि पर प्रभाव के इस प्रकार, प्रयुक्त जानवर की संख्या कम से कम है और विस्तृत अध्ययन संभव है, जो आम तौर पर संभव नहीं है कम समय संकल्प के साथ पारंपरिक नमूना तकनीक का उपयोग कर. हालांकि, हालांकि लय के सापेक्ष आयाम माप संभव हो रहे हैं, यह जोर दिया जाना चाहिए कि रिपोर्टर प्रौद्योगिकी मात्रात्मक नहीं है और इसलिए इस्तेमाल किया जा सकता है नहीं करने के लिए लिखित जीन या अनुवादित प्रोटीन की मात्रा को मापने के.
ऊतक रिकॉर्डिंग और संवर्धन, सीधे vivo में प्रकाश प्रेरित चरण पाली आदि में vivo में तनाव की आणविक प्रभाव, अध्ययन के लिए एक महान लाभ के बाद तुरंत शुरू किया जा सकता विश्लेषण organotypic SCN संस्कृति लंबी अवधि (सप्ताह) वयस्क मस्तिष्क के औषधीय हेरफेर की अनुमति देता है एक अक्षुण्ण परिपक्व synaptic नेटवर्क और luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी युक्त ऊतक कई सप्ताह के लिए स्थिर रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है. इस प्रकार, ऊतक नवजात या जल्दी प्रसवोत्तर क्रम में स्वस्थ संस्कृतियों प्राप्त करने की जरूरत नहीं करता है और तीव्र टुकड़ा पुरानी औषधीय उपचार के विपरीत किया जा सकता है है. सेल संस्कृतियों में प्लाज्मिड संवाददाता transfections, जो कोई डीएनए के जीनोम में शामिल करने के लिए नेतृत्व करने के लिए इसके विपरीत में, ट्रांसजेनिक luciferase पशु मॉडल (के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lenti-वायरस transfections) अनुकूल हैं अगर epigenetic परिवर्तन के लिए अध्ययन किया जा रहे हैं. इस संदर्भ में यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि luminescence इमेजिंग आजकल बेहद संवेदनशील सीसीडी 11 कैमरों के साथ संभव है, एकल SCN न्यूरॉन्स (~ 6-10 सुक्ष्ममापी) और अन्य प्रकार की कोशिकाओं, प्रमुख circadian लय अध्ययन प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग में भी रिकॉर्डिंग की अनुमति है. अंत में, कई circadian जांचकर्ताओं आमतौर पर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे अन्य संवाददाताओं, का उपयोग करने के क्रम में घड़ी जीन / प्रोटीन 16-19 दोलनों अध्ययन आणविक अभिव्यक्ति की निगरानी का उपयोग करें.
टुकड़ा मोटाई के पहलुओं
SCN टुकड़ा (200-300 सुक्ष्ममापी) के यहाँ की सिफारिश की thicknesses या कम किया जा सकता वृद्धि हुई है अगर वांछित. हालांकि, हालांकि ऊतक झिल्ली पर संस्कृति में कुछ दिनों के बाद बाहर दुबला बना देती है है, यह शुरू में कटौती टुकड़ा की 500 सुक्ष्ममापी मोटाई से अधिक के क्रम में 7 ऊतक की व्यवहार्यता की रक्षा की सिफारिश नहीं है. एक टुकड़ा 100 सुक्ष्ममापी की तुलना में पतली यांत्रिक और व्यावहारिक कारणों को संभालना मुश्किल है. क्योंकि SCN ऊतक विषम है टुकड़ा की मोटाई luciferase उत्पादन में संकेत के चरण को प्रभावित कर सकता है के बाद से, SCN है (उदाहरण के लिए "खोल", और पृष्ठीय बनाम वेंट्रल क्षेत्रों बनाम "कोर") के भीतर विभिन्न क्षेत्रों के विभिन्न चरणों के साथ थरथराना 20 और विभिन्न चरण के बाद फिर से सिंक्रनाइज़ 21 बदलाव है . स्लाइस की मोटाई भी फोटान गणना के आधारभूत को प्रभावित करता है के बाद से अधिक ऊतक फोटॉनों की एक बड़ी संख्या उत्सर्जन करता है. आणविक दोलनों के आयाम इस तरह परोक्ष रूप से explant के आकार से प्रभावित हो सकता है. इन कारणों के लिए, नियंत्रण और इलाज संस्कृतियों हमेशा एक ही आकार, मोटाई, और चाहिए क्रम में करने के लिए एक ही चरण में और एक ही आयाम के साथ थरथराना SCN के एक ही क्षेत्र युक्त. दो एकतरफा नाभिक, दूसरे हाथ पर, चरण में एक दूसरे के साथ और लंबे समय के रूप में इसी तरह के आयाम के साथ थरथराना vibratome कटौती के रूप में क्षैतिज और (जो बारी में है कि सेरिबैलम और दो गोलार्द्धों के बीच कटौती जुदाई सीधा है पर निर्भर है angled नहीं है मेज की सतह के लिए). एक अन्वेषक जो SCN संवर्धन करता अनुभव हो सकता है कि SCN संस्कृतियों चरण में एक दूसरे के साथ नहीं थरथराना है. अभ्यास और टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक के मानकीकरण यानी, स्लाइस हमेशा SCN rostro – दुम के समान स्तर पर काट रहे हैं, परिणाम में सुधार होगा.
महत्वपूर्ण कदम
- आक्सीजन की आपूर्ति महत्वपूर्ण है.
क्योंकि मस्तिष्क 22 ऑक्सीजन का एक बहुत आवश्यकता है, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया करने के लिए जल्दी की जरूरत है (3.1-3.10 करीब ~ 5-6 मिनट के लिए बेहतर है यह क्रम में ऊतकों को स्वस्थ रखने के है ). - SCN तापमान परिवर्तन और मध्यम मुद्रा के प्रति संवेदनशील है.
SCN तापमान संवेदनशील है और बड़े तापमान में परिवर्तन चरण पेसमेकर बदलाव कर सकते हैं और प्रयोगात्मक कलाकृतियों के कारण 23. यदि मध्यम या समाधान का आदान – प्रदान कर रहे हैं या उदाहरण के लिए चल रहे एक प्रयोग है, जब संस्कृति में दिन के एक जोड़े के बाद एक दवा को लागू करने, मध्यम या solutio के दौरान जोड़ाn पूर्व गर्म 36-37 के लिए डिग्री सेल्सियस (चैम्बर में के रूप में एक ही तापमान) से पहले इसके अलावा हो की जरूरत है. औषधीय प्रयोगों है कि मध्यम एक्सचेंजों को शामिल में, यह हमेशा पूर्व वातानुकूलित सेल संस्कृति माध्यम के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है. जोड़ / ताजा के साथ बाहर धोने, असुविधाजनक मध्यम संभावित आणविक SCN 24 ताल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य कोशिका प्रकार 25 संस्कृतियों बदलाव चरण कर सकते हैं. - मध्यम रचना.
यह सही पीएच और osmolality में टिशू कल्चर के लिए महत्वपूर्ण है. मध्यम हवा – बफरिंग HEPES की एक बड़ी राशि है, जो एक इष्टतम पीएच 6.8-8.2 की रेंज में बफर क्षमता है और पीएच परिवर्तन है कि सेल श्वसन का एक परिणाम के के रूप में हो सकता है बफरन के लिए भी उपयुक्त है शामिल हैं. HEPES, दूसरे हाथ पर, अधिक तापमान के रूप में सोडियम बिकारबोनिट, जो संस्कृति के माध्यम में छोटी मात्रा में शामिल है के साथ तुलना में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है. सोडियम बिकारबोनिट कम पीएच (5.1-7.1) 26 रेंज, इस तरह सीओ 2 के वातावरण में उपयुक्त में एक बड़ा बफरिंग क्षमता है . हालांकि, हवा बफरिंग मध्यम (2902 DMEM) में सोडियम बिकारबोनिट की मात्रा में वृद्धि हुई osmolality काफी बढ़ जाती है और साथ ही मध्यम, जो अमीनो एसिड, विटामिन, और आयनों के गलत संरचना में बारी परिणामों में. गिराए बिना नहीं कर सकते हैं जोड़ा है
मध्यम तैयारी के लिए सलाह:- सटीक और सावधान रहो, जब मध्यम मिश्रण.
- केवल ताजा या हौसले से thawed शेयर समाधान का उपयोग करें.
- बहुत ही उच्च osmolality के मामले में यह गिराए लायक नहीं है. 5-6% से अधिक पतला मध्यम सबसे अधिक संभावना काम नहीं करेगा. D शर्करा का प्रयोग osmolality वृद्धि अगर यह बहुत कम है.
- चरण तैयारी के समय के कारण बदलाव
टुकड़ा की तैयारी के समय महत्वपूर्ण है. चरण पर शून्य या न्यूनतम प्रभाव अगर टुकड़ा प्रक्रिया ZT 6-12 12 के बीच किया जाता है प्राप्त की है. सभी टुकड़ा dissections प्रतिदिन या circadian चक्र का एक ही चरण में प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्रम में के लिए तैयारी के बीच भिन्नता चरण की वजह से त्रुटि कम से कम.
संभावित संशोधनों
- बफर, टुकड़ा करने की क्रिया शुरू होने से पहले ऑक्सीजन (95% 2 हे, 5% सीओ 2) के साथ संतृप्त, तीव्र SCN इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए टुकड़ा करने की क्रिया (ACSF कृत्रिम Cerebro स्पाइनल द्रव) घंटी के साथ प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, ऑक्सीजन लगातार बफर करने के लिए पूरे टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान जोड़ा, बिजली और synaptic गतिविधि के रूप में सीधे ऑक्सीजन की आपूर्ति 22 पर निर्भर है की जरूरत है.
- क्षैतिज और बाण के समान स्लाइस भी सफलतापूर्वक तैयार किया जा सकता है और SCN के सुसंस्कृत. लेखकों क्षैतिज स्लाइस में luciferase रिकॉर्डिंग है, जो हमारे अनुभव के अनुसार कम आयाम के साथ circadian दोलनों देने के रूप में राज्याभिषेक कटौती के साथ तुलना के साथ अनुभव है.
- SCN लगभग 1 मिमी लंबे rostro caudally है और टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक यहाँ वर्णित मध्य क्षेत्र में एक SCN अनुभाग प्राप्त करने की ओर लक्षित है. हालांकि, एक से अधिक SCN अनुभाग माउस और चूहे के दिमाग से प्राप्त किया जा सकता है, SCN नाभिक के अधिक व्याख्यान चबूतरे वाला बनाम दुम स्तर पर circadian अभिव्यक्ति / जीन प्रोटीन की जांच की अनुमति.
- स्लाइस संस्कृतियों, छोटे जानवरों, प्रसवोत्तर पिल्ले या यहाँ तक कि भ्रूण से भी तैयार किया जा सकता है. कृपया ध्यान दें कि खोपड़ी और बहुत छोटे पिल्ले में मस्तिष्क बहुत नरम और संवेदनशील हैं. इसके अलावा, ऑप्टिक तंत्रिका पतली और पूरी तरह से विकसित नहीं है. सावधानी जब पिल्ले के मस्तिष्क विदारक SCN क्षेत्र इतना है कि क्षतिग्रस्त नहीं है ले लो. उदाहरण के लिए, माइक्रो rongeur उपकरण माउस पिल्ले की खोपड़ी खोलने का उपयोग नहीं किया क्योंकि वे बहुत बड़े हैं कर सकते हैं. ठीक कैंची युवा पिल्ले में मुलायम ऊतकों में कटौती करने के लिए पर्याप्त हैं.
- कवर कांच आधारित संस्कृति यहाँ वर्णित तकनीक भी छवि एक सीसीडी / EM-सीसीडी कैमरा का उपयोग करते हुए एकल SCN न्यूरॉन्स में भी luminescence के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- अन्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र क्षेत्रों और ट्रांसजेनिक PER2 से परिधीय अंग के ऊतकों: ल्यूक जानवरों को आसानी से प्राप्त किया जा सकता है सभ्य और आणविक दोलनों के संदर्भ में विश्लेषण के रूप में PER2: ल्यूक अभिव्यक्ति के लिए कई दिनों के लिए अन्य ऊतकों की एक संख्या में भी थरथराना जारी और सेल 10 प्रकार के. इन परिधि के ऊतकों में से अधिकांश, उदाहरण जिगर के लिए, अस्तित्व के लिए एक झिल्ली की आवश्यकता नहीं है, लेकिन बजाय सीधे मध्यम 11 में नहाया सुसंस्कृत . कृपया ध्यान दें कि सेक्शनिंग करने के लिए कारण स्थानांतरण चरण, संवर्धन और मध्यम विनिमय SCN के लिए के रूप में एक ही सिद्धांतों का पालन नहीं हो सकता है.
महत्व
ट्रांसजेनिक माउस और चूहा उपभेदों (mPER2: ल्यूक, mPer1 8 – ल्यूक, 10, 27) में luciferase एंजाइम गतिविधि प्रोटीन या जीन की अभिव्यक्ति की लय को दर्शाता है और bioluminescence रिकॉर्डिंग के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. bioluminescence luciferase उत्पन्न एक कमजोर संकेत देता है, लेकिन पृष्ठभूमि luminescence शून्य के करीब है, इस विधि फायदेमंद बना. इसके अलावा, क्योंकि luciferase अणु अस्थिर है और तेजी से अपमानित पीएच नहीं हैototoxicity है, जो लंबी अवधि के उत्तेजक 28 रोशनी के दौरान प्रकट कर सकते हैं. साथ में ले ली, इन गुणों लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी अत्यधिक circadian अनुसंधान के क्षेत्र में लाभप्रद बनाने की अनुमति देते हैं.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
000000000091984 FONCICYT, Jeansson की नींव, Söderström Königska sjukhemmet, मरथा Lundqvist और Sigurd OCH Elsa यह काम स्वीडिश चिकित्सा अनुसंधान परिषद (K2009-75SX – +२१०२८-01-3, K2008-61X-२०७००-01-3) द्वारा वित्त पोषित किया गया था Goljes Minne, और SLS 95,151 मेडिसिन के स्वीडिश सोसाइटी. प्रोफेसर जीन डी ब्लॉक, UCLA, कृतज्ञता पांडुलिपि पर बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए स्वीकार किया है. हम HCN चैनल अवरोधक के लिए डॉ. माइकल Andäng और डॉ. हेलेना Johard धन्यवाद, और वीडियो खुर्दबीन प्रदान करने के लिए प्रो अब्दुल अल – Manira.
नैतिक आधार:
सभी जानवरों पर प्रयोगों के कारोलिंस्का Institutet और "स्टॉकहोम Norra Djurförsöksetiska Nämnd" द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. सभी पशु प्रयोगों इरादे के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं किसी भी संभावित तनाव या पशु के लिए परेशानी कम से कम.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| B27 supplement 50x | Invitrogen/Gibco | 17504-044 | ||
| Cover glasses | Menzel-Gläser | 40#1 | ≈ 40 mm | |
| Culture membranes | Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm | |
| DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma | D2902 | Powder for 1L | |
| Filter paper | Whatman | 1003 055 | ≈ 55 mm | |
| Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μm Polyethersulfone | |
| Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 | |
| HEPES | Invitrogen/Gibco | 15630-056 | 100 ml | |
| HBSS 10x | Invitrogen/Gibco | 14065-049 | 500 ml | |
| NaOCH3 7.5% | Invitrogen/Gibco | 25080-060 | 50 ml | |
| Luciferin | Promega | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt | |
| Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | ||
| PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | 100 ml | |
| Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm | |
| PMT | Hamamatsu | H9319-11MOD | ||
| Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 | |
| Vacuum filter | Fisher | 09-761-5 | ||
| Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | ||
| Vibratome | Campden Instruments |
Referências
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
- Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
- Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
- Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
- Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus–The mind’s clock. , 13-15 (1991).
- Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. a. y. Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
- Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- O’Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
- Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
- Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
- LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
- Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
- Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
- Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
- Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
- Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
- Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
- Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
- Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).
