אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic
Summary
הליך של הכנת פרוסות המכיל את עכבר מבוגר ההיפותלמוס גרעין suprachiasmatic (SCN), ודרך מהירה לתרבות רקמת SCN במצב תרבות organotypic, הם דיווחו. יתר על כן, במדידה של הגן oscillatory ביטוי חלבון שעון דינאמי באמצעות כתב הטכנולוגיה בלוציפראז מתואר.
Abstract
השעון הביולוגי המרכזי (~ 24 שעות) תיאום מקצבים יומיים פיסיולוגיה והתנהגות מתגורר גרעין suprachiasmatic (SCN) הממוקם בהיפותלמוס הקדמי. השעון מסונכרן ישירות על ידי אור דרך הרשתית ועצב הראייה. תנודות היממה מופקים על ידי אינטראקציה לולאות משוב שלילי של מספר "גנים של השעון" מה שנקרא מוצרי החלבון שלהם, כולל התקופה (פר) גנים. השעון הליבה תלוי גם שלילת קוטביות הממברנה, סידן cAMP 1. SCN מראה תנודות יומי בביטוי שעון הגן, פעילות מטבולית לבין פעילות חשמלית ספונטנית. למרבה הפלא, זו פעילות מחזורית אנדוגני נמשכת פרוסות הרקמה הבוגרת SCN 2-4. בדרך זו, השעון הביולוגי יכול בקלות להיות למד במבחנה, המאפשר חקירות מולקולרית, אלקטרו ומטבוליים של פונקציית קוצב לב.
SCN הוא קטן, מוגדר היטב מבנה דו ממוקם ממש מעל התצלובת האופטית 5. בשנת החולדה היא מכילה ~ 8.000 נוירונים בגרעין כל יש ממדים של כ 947 מיקרומטר (אורך ציר rostrocaudal) x 424 מיקרומטר (רוחב) x 390 מיקרומטר (גובה) 6. כדי לנתח את SCN יש צורך לחתוך פרוסת המוח ברמה מסוימת של המוח שבו ניתן לזהות SCN. כאן, אנו מתארים את הליך הניתוח, חיתוך של SCN, אשר דומה העכבר מוחות העכברים. יתר על כן, אנו מראים כיצד תרבות רקמות גזור organotypically על קרום 7, טכניקה שפותחה על ידי התרבות רקמת SCN ימזאקי et al. 8. לבסוף, אנו מדגימים כיצד רקמה מהונדס יכול לשמש למדידת ביטוי של גנים של השעון / חלבונים באמצעות כתב דינמי טכנולוגיה בלוציפראז, שיטה במקור שימש למדידות היממה על ידי Geusz et al. 9. אנחנו כאן להשתמש ברקמות SCN מן מהונדס עקום ב PERIOD2: עכברים בלוציפראז המיוצר על ידי יו ואח' 10.. העכברים מכילים חלבון היתוך תקופה (PER) 2 ו בלוציפראז אנזים הגחלילית. כאשר PER2 מתורגם בנוכחות המצע עבור בלוציפראז, כלומר luciferin, הביטוי PER2 ניתן לנטר כמו פליטת אור כאשר בלוציפראז מזרז חמצון של luciferin. מספר הפוטונים הנפלטים חיובי בקורלציה לכמות חלבון המיוצר PER2, לבין מקצבים פליטת אור להתאים את קצב חלבון PER2 in vivo 10. בדרך זו וריאציה מחזורית בביטוי PER2 ניתן לפקח באופן רציף בזמן אמת במהלך ימים רבים. הפרוטוקול אנו עוקבים עבור culturing רקמות בזמן אמת, הקלטה פליטת אור תוארה באופן יסודי על ידי ימזאקי ו טקהאשי 11.
Protocol
Discussion
יתרונות וחסרונות עם טכנולוגיית הכתב בלוציפראז
בניגוד לשיטות לשעבר vivo, כגון RT-PCR, ב הכלאה באתרו כתם המערב שדורשים דגימה רקמה על רבים בנקודות זמן שונות (מתן החלטה זמן נמוכה בדרך כלל 2-4 שעות, תלוי תדר הדגימה) כדי ללמוד יומי וריאציות ביטויי גנים וחלבונים, הטכנולוגיה מאפשרת כתב בלוציפראז ברזולוציה גבוהה (10-10 דקות) מחקרים של תנודות היממה במשך ימים רבים בהכנת אותו. מחקרים לכן, את מספר בעלי החיים המשמשים ממוזער ומפורט של השפעות על שלב ותקופת קצב הם ריאלי, אשר בדרך כלל אינו אפשרי תוך שימוש בטכניקות דגימה קונבנציונלי עם רזולוציה נמוכה זמן. עם זאת, אף על פי מדידות האמפליטודה היחסית של קצב אפשריים, יש להדגיש כי הטכנולוגיה הכתב אינו כמותי ולכן יכול לא להשתמש כדי למדוד כמויות של גנים או חלבונים עיבד המתורגם.
ההקלטות רקמה ניתן להתחיל לנתח מיד לאחר culturing, יתרון גדול עבור ישירות לומד המולקולרי של תופעות של מתח vivo, in vivo אור-Induced משמרות שלב וכו 'תרבות SCN organotypic מאפשר לטווח ארוך (שבועות) מניפולציה תרופתי של המוח המבוגר רקמה המכילה מערך שלם הסינפטי בוגרת הטכנולוגיה כתב בלוציפראז מאפשר הקלטות יציבה במשך שבועות רבים. לפיכך, הרקמה לא צריך להיות לאחר הלידה בילוד או מוקדם כדי להשיג תרבויות בריא, בניגוד לטיפולים תרופתיים כרונית חריפה פרוסה יכול להתבצע. בניגוד לכתב פלסמיד-transfections בתרביות תאים, אשר אין לעשות להוביל שילוב של ה-DNA לתוך הגנום, מהונדס בלוציפראז דגמים בעלי חיים (כמו גם lenti וירוס transfections) הם נוחים אם שינויים epigenetic הם להיחקר. ראוי בהקשר זה גם לציין כי הדמיה הארה היא כיום אפשרי עם רגישות גבוהה מצלמות CCD 11, המאפשר הקלטות גם נוירונים SCN יחיד (~ 60-10 מיקרומטר) ואת סוגי תאים אחרים, מנוצל על ידי מעבדות מרכזי לימוד מקצבים היממה. לבסוף, החוקרים היממה כמה נפוץ השימוש ניטור הביטוי מולקולריים באמצעות כתבים אחרים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, כדי ללמוד בגן השעון / תנודות חלבון 16-19.
היבטים של עובי פרוסת
עוביים המליצה פה של הפרוסה SCN (200-300 מיקרומטר) יכול להיות מופחת או מוגבר אם תרצה בכך. עם זאת, למרות רקמת משתטחת על קרום אחרי כמה ימים בתרבות, לא מומלץ לעלות על 500 מיקרומטר עובי של הפרוסה לחתוך תחילה כדי לשמר יכולת הקיום של הרקמה 7. פרוסה דק יותר הוא 100 מיקרומטר סיבות מכניות ומעשי קשה להתמודד. מכיוון רקמת SCN הטרוגנית עובי של הפרוסה עשויים להשפיע על השלב של אות פלט בלוציפראז, שכן אזורים שונים בתוך SCN (למשל את "הליבה" מול "קליפה", ואזורים הגב לעומת הגחון) להתנדנד עם שלבים שונים 20 ו דיפרנציאלי מחדש לסנכרן לאחר שלב משמרות 21. עובי של הפרוסה משפיע גם על בסיס של פוטון לספור מאז רקמות פולט יותר מספר גדול יותר של פוטונים. המשרעת של תנודות מולקולריות יכול בדרך זו בעקיפין להיות מושפע גודל explant. מסיבות אלה, מלאה תרבויות התייחסו תמיד צריך להיות באותו עובי של גודל, המכילים את אותו אזור של SCN מנת להתנדנד בשלב אותו עם אמפליטודה זהה. שני גרעינים חד צדדית, מצד שני, להתנדנד בשלב אחד עם השני ועם אמפליטודות דומה עוד לחתוך vibratome הוא אופקי ולא זוויתי (אשר בתורו תלוי כי ההפרדה בין המוח הקטן לחתוך את שתי ההמיספרות הוא בניצב על פני השטח טבלה). החוקר אשר מבצע culturing SCN יכול לחוות תרבויות SCN לא להתנדנד בשלב אחד עם השני. תרגול סטנדרטיזציה של הטכניקה חיתוך, כלומר את הפרוסות נחתכות תמיד ברמה rostro-הזנב אותו SCN, תשפר את התוצאה.
צעדים קריטיים
- אספקת החמצן הוא קריטי.
מכיוון שהמוח דורש הרבה חמצן 22, ההליך חיתוך צריך להיות מהיר (ככל 3.1-3.10 הוא ~ 5-6 דקות זה יותר טוב כדי לשמור על הרקמה הבריאה). - SCN הוא רגיש לשינויי טמפרטורה וחילופי בינוני.
SCN הוא רגיש לשינויי טמפרטורה הטמפרטורה גדול יכול להסיט את שלב קוצב לב ולגרום ממצאים ניסיוניים 23. אם בינוני או פתרונות מוחלפים או הוסיף במהלך ניסוי מתמשך, למשל כאשר החלים תרופה אחרי כמה ימים בתרבות, הבינוני או solution צריך להיות מחומם מראש ל 36-37 ° C (הטמפרטורה זהה בתא) לפני כן. בניסויים פרמקולוגיים הכוללים חילופי בינוני, חשוב תמיד לעבוד עם מדיום מראש מותנה תרבית תאים. תוספת / לשטוף החוצה עם טרי, בינוני מותנית עלולה שלב משמרת את הקצב SCN מולקולריים 24, כמו גם סוג תא אחר תרבויות 25. - בינוני הרכב.
חשוב בתרבות רקמות pH osmolality הנכונים. בינוני אוויר חציצה מכיל כמות גדולה של HEPES, אשר בעל קיבולת חיץ אופטימלי בטווח של 6.8-8.2 pH ו מתאים גם חציצה השינויים pH שעלולות להתרחש כתוצאה הנשימה בתא. HEPES, מצד שני, הוא רגיש יותר לשינויי טמפרטורה לעומת סודיום ביקרבונט, הכלולה בכמויות קטנות ובינוניות התרבות. סודיום ביקרבונט בעל קיבולת חציצה גדולה יותר ב-pH נמוך יותר (5.1-7.1) טווח 26, המתאימה ובכך באווירה CO 2. עם זאת, כמויות גדולות יותר של סודיום ביקרבונט במדיום אוויר חציצה (DMEM 2902) מגדילה את osmolality משמעותית ולא ניתן להוסיף בו זמנית ללא דילול בינוני, שבתורה גוררת בהרכב נכונה של חומצות אמינו, ויטמינים יונים.
עצות להכנת בינוני:- הייה מדויק וזהיר כאשר ערבוב הבינוני.
- השתמש פתרונות מניות טרי או מופשר רק עתה.
- במקרה של osmolality גבוהה מאוד זה לא שווה דילול. יותר מ 5-6%, בדילול בינוני סביר להניח שלא לעבוד. שימוש D-גלוקוז להגדיל osmolality אם היא נמוכה מדי.
- שלב משמרות עקב זמן ההכנה
זמן הכנה פרוסה היא קריטית. השפעה מינימלית על אפס או שלב מתקבל אם ההליך פרוסה מתבצע בין ZT דצמבר 06-12. והניתוחים כל פרוסה צריכה להתבצע בשלב זהה של מחזור יומי או היממה כדי למזער שגיאות עקב וריאציה בין שלב ההכנות.
שינויים אפשריים
- עבור electrophysiology SCN חריפה, החיתוך צריך להתבצע עם Ringer (מלאכותית נוזל השדרה Cerebro; ACSF) חוצץ, רווי חמצן (95% O 2, 5% CO 2) לפני תחילת חיתוך. יתר על כן, חמצן צריך להוסיף ברציפות למאגר במהלך ההליך כולו חיתוך, כמו הפעילות החשמלית הסינפטי תלויה ישירות על אספקת חמצן 22.
- פרוסות אופקי sagittal יכול גם להיות מוכנים בהצלחה תרבותי של SCN. המחברים יש ניסיון עם הקלטות בלוציפראז ב פרוסות אופקיות, אשר על פי הניסיון שלנו לתת תנודות היממה עם משרעת נמוכה יותר בהשוואה לחתוך את העטרה.
- SCN הוא כ 1 מ"מ ארוך rostro-caudally ואת טכניקת חיתוך המתואר כאן הוא ממוקד כלפי רכישת סעיף SCN באזור המרכז. עם זאת, אחד או יותר סעיף SCN ניתן להשיג עכבר מוח החולדה, המאפשר חקירה של ביטוי גנים / חלבונים היממה ברמות מקורי יותר מול הזנב של הגרעין SCN.
- תרבויות Slice מבעלי חיים הצעיר, הגורים לאחר הלידה, או אפילו עוברים, יכול גם להיות מוכנים. שים לב המוח לגולגולת גורים צעירים מאוד רכים מאוד רגיש. בנוסף, עצב הראייה הוא דק ולא מפותחת. קח זהירות בעת לנתח את המוח של הגורים כל כך את האזור SCN אינו פגום. למשל, מיקרו כלים rongeur לא ניתן להשתמש כדי לפתוח את הגולגולת של גורים העכבר כי הם גדולים מדי. מספריים פיין הם מספיק כדי לחתוך את הרקמות הרכות של גורים צעירים.
- הזכוכית המכסה טכניקה המבוססת תרבות המתואר כאן יכול לשמש גם כדי הארה תמונה באמצעות מצלמה CCD / EM-CCD, גם בנוירונים SCN יחיד.
- באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית ורקמות איברים מן הפריפריה מהונדס PER2:: בעלי חיים לוק יכול בקלות לקבל, תרבותי ניתח במונחים של תנודות מולקולריות, כמו PER2: הביטוי לוק ממשיך להתנדנד במשך ימים רבים גם במספר רקמות אחרות תא 10 סוגים. רוב אלה ברקמות הפריפריה, על הכבד, למשל, אינם דורשים קרום להישרדות אך במקום מתורבת טובל ישירות 11 בינוני. שים לב כי בשלב הסטה עקב חתך, culturing וחילופי בינוני לא יכול לעקוב אחר אותם עקרונות כמו SCN.
משמעות
בשנת עכבר מהונדס ועל זני חולדה (mPER2: לוק; mPer1 לוק 8, 10, 27) פעילות האנזים בלוציפראז משקף חלבון או ביטוי גנים מקצבים ניתן להעריך על ידי הקלטה פליטת אור. פליטת אור בלוציפראז שנוצר נותן אות חלש אבל הארה הרקע הוא קרוב לאפס, מה שהופך שיטה זו יתרון. יתר על כן, כי המולקולה אינה יציבה בלוציפראז ו מושפל במהירות יש ph לאototoxicity, אשר יכול להופיע במהלך תאורה לטווח ארוך מעורר 28. יחדיו, תכונות אלו מאפשרות לטווח ארוך ביצוע ניסויים בטכנולוגיה כתב בלוציפראז יתרון מאוד במחקר היממה.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר רפואי שוודית (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; יסודות Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, מרתה Lundqvist ו סיגורד och אלזה Goljes Minne; חברה שוודית לרפואה SLS-95151. פרופ 'ג'ין ד בלוק, UCLA, היא הודתה בהכרת תודה על הערות מועילות על כתב היד. אנו מודים ד"ר מיכאל Andäng וד"ר הלנה Johard עבור חוסם את הערוץ HCN, פרופ 'עבד אל Manira לאספקת מיקרוסקופ וידאו.
שיקולים אתיים:
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי קרולינסקה Institutet ו "Norra של שטוקהולם Djurförsöksetiska Nämnd". כל הניסויים בבעלי חיים מבוצעות מתוך כוונה למזער את כל הלחץ האפשרי או חוסר נוחות לבעל החיים.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| B27 supplement 50x | Invitrogen/Gibco | 17504-044 | ||
| Cover glasses | Menzel-Gläser | 40#1 | ≈ 40 mm | |
| Culture membranes | Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm | |
| DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma | D2902 | Powder for 1L | |
| Filter paper | Whatman | 1003 055 | ≈ 55 mm | |
| Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μm Polyethersulfone | |
| Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 | |
| HEPES | Invitrogen/Gibco | 15630-056 | 100 ml | |
| HBSS 10x | Invitrogen/Gibco | 14065-049 | 500 ml | |
| NaOCH3 7.5% | Invitrogen/Gibco | 25080-060 | 50 ml | |
| Luciferin | Promega | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt | |
| Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | ||
| PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | 100 ml | |
| Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm | |
| PMT | Hamamatsu | H9319-11MOD | ||
| Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 | |
| Vacuum filter | Fisher | 09-761-5 | ||
| Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | ||
| Vibratome | Campden Instruments |
Referências
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
- Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
- Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
- Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
- Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus–The mind’s clock. , 13-15 (1991).
- Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. a. y. Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
- Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- O’Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
- Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
- Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
- LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
- Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
- Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
- Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
- Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
- Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
- Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
- Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
- Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).
