Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

1. Herstellung der Lösung Kulturmedium mit Luft-Pufferkapazität Füllen Sie eine 1 Liter Flasche mit ca. 800 ml sterilem H 2 O (autoklaviert milliQ H 2 O). Unter Rühren hinzufügen und mischen folgende Stoffe: 1 Behälter zu niedrigen Blutzuckerwerten, serumfreien DMEM 2902 Pulver ohne Natriumbicarbonat und Phenolrot (Phenolrot stört die Biolumineszenz-Signal), 20 mL B27 ergänzen 50x, 4,7 ml einer 7,5% NaHCO 3 Lösung (oder 0,35 g NaHCO 3), 10 ml HEPES 1M, 2,5 mL PenStrep 10.000 U / mL und 3,5 g D-Glucose. Lassen Sie das Medium rühren, bis die Zutaten vollständig gelöst sind. Das fertige Medium (1 Liter) wird enthalten: 1x DMEM, 1x B27 ergänzen, 4,2 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 25 U / ml Penicillin, 25 U / ml Streptomycin und 19 mM D-Glucose. Der pH-Wert auf 7,2 mit NaOH zu verringern oder HCl auf den pH-Wert zu erhöhen, und bringen Volumen bis zu 1 Liter mit sterilem H 2 O. Passen Osmolalität mit H 2 O (Abnahme Osmolalität) oder D-Glucose (Erhöhung der Osmolalität). Die Osmolalität ist zwischen 285-315 mOsm / kg, aber im optimalen Bereich ist 300-310 mOsm / kg. Nicht auf das Medium mehr als 5% zu verdünnen. Filter das Kulturmedium mit Corning sterile Vakuumfiltration setzt (zB 2 x 500 mL mit einer Porengröße von 0,22 um) in eine sterile Haube. Halten Sie das Medium, in 4 ° C und schützen sie vor Licht mit Aluminiumfolie. Wir empfehlen, dass das Medium innerhalb von 3 Monaten verwendet wird. Hanks balanced salt solution (HBSS) Puffer mit Ergänzungen (zum Schneiden von Scheiben) Füllen Sie eine 1-Liter-Glasflasche mit ~ 600 mL sterile (autoklaviert milliQ) H 2 O und fügen Sie die folgenden Substanzen: 100 mL HBSS 10fach, 10 mL Penicillin-Streptomycin 10.000 U / ml, 5 ml einer 7,5% igen NaHCO 3-Lösung und 10 mL HEPES 1M. Der letzte Schnitt-Lösung enthält: 1x HBSS, 10 mM HEPES, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / ml Penicillin und 100 U / ml Streptomycin. Überprüfen Sie pH-Wert und, falls erforderlich, pH-Wert auf 7,2 und bringen das Volumen bis zu 1 Liter mit sterilem H 2 O. Überprüfen Sie Osmolalität, die muss zwischen 285-315 mOsm / kg. Kühlen Sie die HBSS auf 4 ° C. Die HBSS-Puffer muss sehr kalt sein (4 ° C) beim Schneiden / Schneiden Verfahren in Ordnung zu bringen den Stoffwechsel und die Erhaltung Gewebeviabilität. 2. Vorbereitungen vor dem Schneiden und Kultivieren Slices Die Gewebe werden in einem warmen, trockenen Raum ohne CO 2 kultiviert. Zur Vermeidung von Austrocknung der Kulturen müssen mit Deckgläsern an die Gerichte durch Fett abgedichtet werden. Zu diesem Zweck füllen 5 ml Spritzen mit Silikon-Vakuum-Fett. Decken Sie die Kanülen mit kleinen Stücken aus Aluminiumfolie und autoklavieren sie. Auch Autoklaven Filterpapiere (verwendet beim Schneiden Verfahren). Rechts vor dem Schneiden Verfahren gelten autoklaviert Vakuumfett auf dem oberen Ring Fläche von 35 mm Petrischalen. Bereiten Sie einen separaten Petrischale für jede Scheibe Kultur. Vor Beginn der Slicing Verfahren alle nicht-sterile Instrumente, Rasierklingen, Vibratom Klingen, Deckgläser und anderes Material für die Scheibe und Kultur Verfahren verwendet wurden, um sterilisiert werden. Spray alle nicht-steriler Ausrüstung mit 70% Ethanol. Expose die Instrumente und die gefettete Petrischalen mit UV in einem sterilen Haube für mindestens 30 Minuten UV-Exposition vor Kultivierung. Zur gleichen Zeit, füllen Sie eine Falcon-Röhrchen mit Luft-Buffering Kulturmedium (count 1,2 ml für jede Kultur, für 8 Kulturen vorzubereiten etwa 10 mL Medium) und fügen Sie frisch aufgetaute Luciferin (0,1 M Stammlösung; Promega, Madison, WI) (10 l Luciferin zu 10 ml Medium; Endkonzentration 0,1 mM). Das Luciferin ist lichtempfindlich und sowohl Stammlösungen und das Luciferin-haltigem Medium muss vor Licht geschützt werden. Legen Sie die Falcon-Röhrchen mit Luciferin-Medium in einem dunklen 36-37 ° C Heizkammer. Gegebenenfalls kann das Luciferin auch direkt in die Kulturschalen zum Zeitpunkt des Schneidens hinzugefügt werden. Wenn Luciferin nicht hinzugefügt wird, wird es keine leichte Reaktion zwischen Luciferase und Luciferin und deshalb kein Signal aus dem Gewebe. Nach der UV-Exposition, fügen Sie eine sterile Klinge zum Vibratom. 3. SCN Slicing Verfahren Das folgende Verfahren beschreibt Aufschneiden der Erwachsenenbildung, in der Regel 2-4 Monate alt, C57/BL6-Mäusen. Bitte beachten: Der Schneidvorgang sowie Belichtung des Tieres während der Nacht, können unterschiedlich Reset der Phase des SCN. Um dies zu vermeiden, sollte die Schneid-und Kultivierung während der hellen Stunden durchgeführt werden, vorzugsweise zwischen ZT 6-12, wenn keine erhebliche Phasenverschiebungen aufgrund des Verfahrens 12 auftreten. Wenn SCN hat in der Dunkelheit abgetastet werden, haben 3,1 und 3,2 auf der roten Ampel oder mit Schutzbrille Nacht durchgeführt werden, um Licht-induzierte Phasenverschiebungen zu vermeiden. Anesthetize der Maus vorzugsweise durch Isofluoran (Baxter) in einem glass Kammer. Wenn das Tier hat seinen Schmerz Reflexe (Prüfung durch Kneifen mit den Nägeln in der Pfote) verloren, aber noch nicht aufgehört zu atmen (um Sauerstoffversorgung zu halten so lange wie möglich), schnell enthaupten den Kopf mit einer Schere oder ähnliches. Bitte beachten Sie: In einigen Ländern CO 2-Exposition (Hyperkapnie) ist immer noch als Betäubungsmittel-Methode erlaubt, auch wenn es berichtet wurde, um tierische Angst zu fördern. Darüber hinaus können Genickbruch vor Enthauptung erforderlich sein. Bitte folgen Sie lokale Gesetzgebungen, wenn euthanizing Tiere. Entfernen Sie die Augen aus dem Kopf mit einer Schere, um Belastungen und weitere Anregung des Sehnerven, die die SCN Schäden verhindern kann. Wenn noch angebracht ist, entfernen Sie die letzten Halswirbelsäule mit einer Schere, die Haut abziehen (Abb. 1a) und stellen zwei Schnitte mit einer feinen Schere (zum Beispiel Iris Schere), ein Schnitt an jeder Seite des Schädels an den Seiten, wodurch einen abnehmbaren "Deckel". Öffnen Sie den Schädel mit einem Mikro Rongeur Tool (fein Präparierscheren kann auch auf eine Maus verwendet werden) und entfernen Sie alle Knochen, bis die Riechkolben gesehen werden kann. Arbeiten nach oben, nie nach unten drücken das Gehirn mit dem Werkzeug, um eine Beschädigung des ventralen SCN (Abb. 1b) zu verhindern. Schneiden Sie vorsichtig den Sehnerv zwischen den Riechkolben und den Hemisphären mit feinen Mikro Sezieren Frühjahr Schere. Stellen Sie sicher, dass der Nerv vollständig geschnitten wird seit Dehnung des Sehnervs führen kann, um in der SCN und geplatzten Scheiben beschädigt. Drehen Sie den Kopf auf den Kopf und lassen Sie das intakte Gehirn herausfallen (falls noch an das Gehirn gebunden, andere Hirnnerven Möglicherweise müssen kaudalen Schnitt des Sehnervs werden) in einen Behälter (zum Beispiel einer Glas-Petrischale ≈ 10 cm) gefüllt mit 50-100 ml kaltem HBSS eine schnelle Kühlung des Gehirns. Im Idealfall sollten die beiden Sehnerven intakt bleiben (Abb. 1c). Halten Sie den Kopf in den HBSS 30-60 Sekunden, um sicherzustellen, das Gehirn gekühlt wird. Mit einem Löffel oder ähnliches und Ort der gekühlten Gehirn, dorsalen Oberfläche bis auf eine sterile Schnittfläche (zum Beispiel einer Glas-Petrischale Deckel auf den Kopf gestellt). Um einen koronalen Schnitt vorzubereiten, machen Sie einen senkrechten Schnitt mit steriler Rasierklingen oder Skalpelle zwischen den Hemisphären und das Kleinhirn, also das Entfernen des Kleinhirns. Bewerben Sekundenkleber auf den trockenen Plattform aus der vibroslicer / Vibratom. Pick-up des Gehirns (Hemisphären ohne Kleinhirn und ohne Riechkolben), indem Sie einen scharfen, gebogenen Pinzette in den rostralen Teil und sorgfältig abtrocknen der HBSS auf einem sterilen Filterpapier, hielt immer noch das Gehirn mit der Zange. (Statt Einsetzen einer Pinzette, ein kleines Stück von sterilem Filterpapier kann zur Befestigung und den Transfer des Gehirns werden). Fix die Hemisphären auf die geklebte Plattform mit der rostralen Spitze nach oben und ventralen Oberfläche am nächsten an der Schneide. Bringen Sie die Plattform in die Halterung aus der Vibratom (zum Beispiel von Campden Instruments, UK) und sofort füllen Sie ihn mit kaltem HBSS. Wenn die senkrechte Schnitt richtig gemacht wird, sollte die Hemisphären gerade aufstehen somit eine gute Winkel notwendig, einen koronalen Schnitt mit den bilateralen SCN. Um das Ziel SCN Gebiet zu erreichen, starten Sie das Abschneiden dickeren Abschnitte (500-800 um) der Hemisphären bei hohen oder maximale Geschwindigkeit des Vibratom. Das Verschieben der Klinge kann man ziemlich schnell am Anfang vor dem Erreichen des Hypothalamus, sollte aber verlangsamt werden, wenn das Chiasma sichtbar (hohe Frequenz der schwingenden Klinge und langsame Bewegung horizontal verringert Zellschäden beim Schneiden, wodurch Scheibe Lebensfähigkeit). Reduzieren Sie die Abschnitte bis 100 um, wenn das Chiasma größer wird (breiter) und die vordere Kommissur wird kleiner. Um eine Mitte-SCN Abschnitt erwerben, arbeiten Sie sich "down" (kaudal), bis die beiden SCN Kerne beginnen zu erscheinen. Eine Lupe kann notwendig sein, zur Visualisierung der Kerne. Bitte beachten: Der SCN im Gehirn der Maus ist mehr caudal des Chiasma gelegen als zum Gehirn der Ratte verglichen. Wenn der gewünschte Grad der SCN erreicht wurde (SCN wird an dieser Stelle erscheinen als mehr definiert, rund oder mandelförmig Strukturen; Abb. 1d; rund Bregma-0.46–0,70 mm für den mittleren Bereich des SCN in der Maus 13, Bregma – 0.92–1,40 mm für Ratten 14), schneiden Sie die SCN Abschnitt (Abb. 1e). Geeignete Dicke der Schicht ist für die Maus 250 ± 50 &mgr; m; für Ratten 350 ± 50 pm. Mit einer weichen Bürste, Lift und übertragen Sie die SCN Scheibe mit einem Deckel aus einer mittleren Petrischale mit kaltem HBSS gefüllt, unter einem Dissektionsmikroskop oder Stereoskop gelegt. Überprüfen Sie unter Vergrößerung, wenn die bilateralen SCN ist deutlich sichtbar. Wenn die Mitte-Region des SCN gewählt (die nicht notwendigerweise der einzige "optimale" Slice-Ebene, sondern, dass wir prüfen, ist der einfachste Weg, um das Schneiden Verfahren zu standardisieren und zu reduzieren Variation), sollte es klar zumindest gesehen werden eine Seite derScheibe Abschnitt. Wenn der Schnitt war zu rostral, einen weiteren Abschnitt und überprüfen Sie die SCN unter Vergrößerung. 4. Organotypische SCN Kultur In der Petrischale Deckel mit HBSS gefüllt, sezieren die bilateralen SCN als Quadrat Gewebe (~ 1,5 mm je Seite) mit einem Paar sterile Skalpelle unter einem Binokular. Ein kleines Stück des Chiasma wird das Explantat verbunden bleiben, aber keine anderen Kerne sollten einbezogen werden. Cut so nah wie möglich ohne Ausbau SCN Gewebe. Gegebenenfalls für das geplante Experiment können die bilateralen SCN dann in zwei Hälften geschnitten werden, um zwei einseitige SCN zu erhalten. Eine einseitige SCN kann dann als Kontrolle (Abb. 2a) verwendet werden. Fill 1200 ul der Luciferin-Medium in ein ≈ 35 mm Petrischale und legen Sie eine Kultur-Membran (Milli-CM 0,4 pm, Millipore, Bedford, MA) auf der Oberfläche der Flüssigkeit (2b). Das Kulturmedium Volumen ist entscheidend, da die Kultur Membran sicher sitzen sollte auf der Basis der Kulturschale, nicht schwimmen oder Felsen in das Medium 11. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen unter der Membran. Vermeiden Sie unnötige Lichtexposition bei der Arbeit mit Luciferin. Die Explantate sind klein und schwer zu holen. Verwenden Sie daher ein 1000 ul Pipette + Spitze der SCN Explantat in die Spitze zu saugen und drücken Sie auf der Membran. Bei der Explantation ist zu groß, um einfach in einem 1000 ul Pipettenspitze (zB Ratte SCN und Maus bilateralen SCN) passen die Spitze kann mit einem sterilen Werkzeug, um eine breitere Öffnung zu schaffen geschnitten werden. Discard übermäßige HBSS auf der Membran mit der Pipette. Für Luciferase Aufnahme statt nur einer SCN / Schale (Abb. 2b) als Aufnahme-Röhren alle Photonen aus der Schale emittiert erkennen und nicht zwischen den Signalen aus verschiedenen Geweben zu unterscheiden. Seal die Schale mit einem Deckglas (≈ 40 mm, Menzel-Gläser, Deutschland) und Vakuum-Fett (Dow Corning Corp, USA) 11. Achten Sie darauf, die Dichtung ist dicht (Abb. 2c). Wenn nicht, mit mehr Fett zu versiegeln. Übertragen Sie die Gerichte zu einer 36-37 ° C lichtdichten Kammer und starten PMT-Aufnahmen sofort. 5. Die Messung der Luciferaseaktivität durch Aufnahme Biolumineszenz Luciferase-induzierte Biolumineszenz-Signale aus dem kleinen SCN Gewebe erkannt und verstärkt mit photonmultiplier-tube (PMT)-Detektor Baugruppen innerhalb eines lichtdichten Kammer montiert. Die PMTs sind in der Regel ~ 1-2 cm oberhalb der Kulturschalen 8 positioniert. PMT Aufnahme-Setups können nach Maß oder sind im Handel erhältlich 11. Die Schale unter einer PMT (die Wärme aus der PMT produziert wird Kondensation auf das Deckglas zu entfernen) und in der Nähe der Kammer. Sicherstellen, dass die Kammer (weniger als 20 Photonen / min) 100% lichtdicht als der dunkle Graf von PMTs für SCN Gewebe verwendet, ist sehr gering. Die PMTs erkennen sogar das schwächste Licht Leckage. Starten Sie die Datenerfassung, die mit Software (z. B. LumiCycle; Actimetrics Inc., Wilmette, IL, USA) durchgeführt wird. Photon zählt, sind über 1-10 min Intervallen integriert, um hohe Auflösung des Gen / Protein-Expression zu bekommen. ClockLab, Actimetrics;; LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono, Till Roenneberg an der Universität München, nach der Aufnahme fertig ist, können die erhaltenen zirkadianen Expression des Gens / Proteins mit entsprechender Software (Origin, OriginLab, Northampton, MA, USA analysiert werden München, Deutschland), um festzustellen Phase (Zeit für einen Zyklus) und die Amplitude des Rhythmus. Der Gipfel Ausdruck der Gen-oder Protein wird meistens als Bezugspunkt verwendet und gilt als die höchste Photonenzahl während eines Zyklus definiert. Die Daten können vor-Analysen der Phase, Periode und Amplitude geglättet werden, insbesondere, wenn das Signal / Rausch-Verhältnis gering ist. Die Grundlinie ändert sich manchmal und müssen abgezogen, bevor die Analysen durchgeführt werden. 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir stellen hier den oszillierenden PER2:: LUC Ausdruck als auslesen für die Lebensfähigkeit und den Zustand des gezüchteten Gewebes. Unter optimalen Bedingungen, und wenn das Gewebe am Leben ist, das PER2:: LUC Ausdruck oszilliert mit einem zirkadianen Rhythmus, wie in Abbildung 3 dargestellt. PER2 in der SCN ist maximal in der Regel rund Zeitgeber Zeit 12-13 (: Dunkel-Zyklus, wo ZT 12 stellt Lichter aus in einem 12:12 h Licht) zum Ausdruck gebracht. Die in der Größe größer die lebendes Gewebe ist, desto höher ist die Photonenzahl wird. Allerdings sollte die Größe und Dicke der organotypically gezüchtetes Gewebe gering gehalten werden, um zu halten das Gewebe lebensfähig, vorzugsweise nicht größer als 15 mm 2 11 und nicht dicker als 500 um 7. Der SCN, wenn seziert wie hier beschrieben, zeigt typischerweise Photonen zwischen 10.000-40.000/min, wenn das Gewebe von einer homozygoten PER2 abgetastet wird:: LUC Tier. Die Amplitude der Schwingung in organotypischen SCN Kulturen ist in der Regel sehr hoch während des ersten Zyklus wie bei den folgenden Zyklen verglichen. Es ist nicht ganz klar, warum der erste Zyklus sehr hohe amplit hatude. Eine mögliche Erklärung ist, dass ein wesentlicher Teil der Zellen in das Gewebe kann in Kürze sterben nach dem ersten Schnitt und Kultivierung, also nicht nutzen Luciferin nach dem ersten Zyklus. Der Schneidvorgang kann auch dazu führen, übermäßige Erregung, die das Luciferase-Signal während des ersten Zyklus verstärken könnte. Abbildung 3 zeigt Lumineszenz Spuren von SCN Scheiben und enthält eine trace (rot) aus einer Scheibe, die nicht ursprünglich gesunden erhalten. Dead or ungesunde Gewebe geringe Photonenzahl Baselines. (Darüber hinaus tote Gewebe häufig in der Schale trennen und können nicht von der Membran in einem Stück entfernt werden.) Die Technik in diesem Bericht beschrieben werden vorteilhaft in pharmakologischen Experimente genutzt werden. Abbildung 4 zeigt eine Spur von einer Kultur, die wir zwischen Tag 1 und 2 behandelt mit einer HCN-Kanal-Blocker (ZD7288, 10 uM). Wie in der Abbildung zu sehen ist und veröffentlicht als vorher 15, der Blocker deutlich reduziert die Amplitude der circadianen Schwingung PER2, aber nach dem Waschen mit normalem Kulturmedium die Schwingung kam zurück, die belegen, dass der Blocker der molekularen Uhr betroffen, aber die Gewebe wurde lebensfähig und gesund. Abbildung 1. Slicing Verfahren A) Der Kopf eines enthaupteten eingeschläfert Maus mit den Augen und der Haut entfernt werden. B) Der Schädel mit einem Mikro Rongeur Werkzeug entfernt wird. Bei Verwendung des Tools muss man nach oben arbeiten und nie nach unten drücken das Gehirn mit dem Werkzeug. C) Das Gehirn auf den Kopf (Bauchseite nach oben), ohne Riechkolben gezeigt. Der weiße Chiasma mit den beiden intakten Sehnerven gesehen werden kann. Die suprachiasmatischen Nukleus (SCN, die Grenzen mit rot markiert) befindet sich nahe dem Chiasma gelegen. D) A koronal geschnitten Gehirn an der Plattform in der vibroslicer, auf der Ebene der SCN. E) Koronar Gehirn Abschnitt (250 &mgr; m dick) mit dem Chiasma (OC), dritten Ventrikel (3V) und die bilateralen suprachiasmatischen Kerne (SCN). Abbildung 2. Organotypischen Gewebekulturen. A) Die beiden einseitigen SCN Kerne (insert) von der Scheibe zerlegt dargestellt. B) Kulturschale (35 mm Petrischale) mit Kultur-Membran-, mittel-und Explantation, aber ohne Vakuum Fett und Deckglas. Das Medium (1,2 ml) kann als Flüssigkeit zwischen die Antenne und die Membran zu sehen. Eine einseitige SCN Kern basiert auf der Kultur-Membran platziert. Der weißeste Teil der kleinen Gewebe ist ein Stück des Chiasma (insert). C) Die Kulturschale mit seiner Membran und seiner SCN Gewebe, mit Vakuum-Fett und eine runde Deckglas versiegelt. Abbildung 3. Biolumineszenz-Aufnahmen von gesunden und nicht gesunden SCN Gewebekulturen. Beispiele für Biolumineszenz Aufnahmen Periode2: LUCIFERASE (PER2:: LUC) Ausdruck in suprachiasmatischen Nukleus (SCN) Scheiben von Mäusen in einem 12h statt erhalten: 12h Licht: Dunkel-Zyklus. Die PER2:: LUC Protein schwingt mit einem zirkadianen (~ 24 Std.) Variante, bei der die maximale Expression des Proteins erfolgt bei Zeitgeber Zeit 12-13. So wird die Phase des Gens Rhythmus abhängig von der Licht-Dunkel-Zeitplan, in denen das Tier gehalten, bevor geopfert wurde. Typischerweise zeigt Biolumineszenz von einseitigen SCN Gewebe präpariert wie in der Anleitung beschriebenen Photonen zwischen ~ 10.000-40.000/minute. Die Abbildung zeigt Spuren von einer gesunden (schwarzen) SCN Kultur, einer Non-gesunde SCN Kultur (rot) und eine SCN Kultur, die aus getrockneten (blau) nach dem Öffnen der versiegelten Kulturschale am Tag 4 und nicht wieder Verschließen der Schüssel richtig ( durch Pfeil gekennzeichnet). Abbildung 4. Biolumineszenz Aufnahme während und nach der Einnahme der Arzneimittel. PER2:: LUC Ausdruck in einer Kultur vor, während und nach der Wirkung eines HCN-Kanal-Blocker (ZD7288, 10 uM). Der erste Pfeil zeigt die Zeit, in der Blocker hinzugefügt wurde. Der zweite Pfeil zeigt Auswaschung, die durch den Austausch des Medikaments Medium mit klimatisierter Kontrolle Medium gemacht wurde. Beachten Sie die reduzierte Amplitude nach 2 Tagen von Substanz-Exposition, fehlende Schwingung am Tag 4 und die schnelle Wiederherstellung des Proteins Rhythmus nach Auswaschen.