Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l'activité des gènes d'horloge dans le noyau suprachiasmatique

1. Préparation de la solution Le milieu de culture avec de l'air-capacité tampon Remplir une bouteille de 1 litre avec environ 800 ml stériles H 2 O (autoclavés milliQ H 2 O). Tout en remuant, ajouter et mélanger des substances suivantes: 1 de glucose contenant faibles, DMEM sans sérum 2902 poudre sans bicarbonate de sodium et rouge de phénol (rouge de phénol interfère avec le signal de bioluminescence), 20 ml B27 complément 50x, 4,7 ml d'un 7,5% de NaHCO 3 solution (ou 0,35 g de NaHCO 3), 10 ml d'HEPES 1M, 2,5 mL Penstrep 10000 U / ml et 3,5 g de D-glucose. Laissez le support remuer jusqu'à ce que les ingrédients soient complètement dissous. Le milieu final (1 litre) doit contenir: 1x DMEM, 1x B27 supplément, 4,2 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 25 U / ml de pénicilline, 25 U / ml de streptomycine et 19 mM de D-glucose. Ajuster le pH à 7,2, en utilisant du NaOH ou du HCl à diminuer pour augmenter le pH, et amener le volume à 1 litre avec H 2 O. stériles Ajustez l'osmolalité avec H 2 O (osmolalité diminution) ou D-glucose (osmolalité augmentation). L'osmolalité doit être comprise entre 285 à 315 mOsm / kg, mais la fourchette optimale est de 300 à 310 mOsm / kg. Ne pas diluer le support de plus de 5%. Filtrer le milieu de culture en utilisant Corning stériles ensembles de filtration sous vide (par exemple 2 x 500 ml avec la taille des pores de 0,22 um) dans une hotte stérile. Gardez le support en 4 ° C et le protéger de la lumière en utilisant du papier d'aluminium. Nous recommandons que le milieu est utilisé dans les 3 mois. Hank solution équilibrée sel (HBSS) tampon avec suppléments (pour les tranches de coupe) Remplir une bouteille verre de 1 litre avec ~ 600 ml stériles (autoclavés milliQ) H 2 O et d'ajouter les substances suivantes: 100 ml de HBSS stock de 10x, 10 ml de pénicilline-streptomycine 10000 U / ml, 5 ml d'un 7,5% solution de NaHCO 3 10 ml d'HEPES 1M. La solution de coupe final contiendra: 1x HBSS, HEPES 10 mM, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / ml de pénicilline et 100 U / ml de streptomycine. Vérifier le pH et, si nécessaire, ajuster le pH à 7,2 et porter le volume à 1 litre avec H 2 O. stériles Vérifiez l'osmolalité, qui doit être comprise entre 285 à 315 mOsm / kg. Refroidir le HBSS à 4 ° C. Le tampon HBSS doit être très froide (4 ° C) pendant le tranchage / coupe procédure afin de faire baisser le métabolisme et de préserver la viabilité des tissus. 2. Préparatifs Avant Tranches de coupe et la culture Les tissus sont cultivés dans une chambre chaude et sèche sans CO 2. Afin d'éviter le dessèchement des cultures doivent être scellés avec des lunettes couvercle attaché à la vaisselle à la graisse. Pour ce faire, remplissez seringues de 5 ml avec de la graisse sous vide à base de silicone. Couvrir les embouts de seringue avec de petits morceaux de papier d'aluminium et les autoclaves. En outre, l'autoclave papiers filtres (utilisé pendant le tranchage procédure). Juste avant le tranchage procédure, appliquer de la graisse à vide autoclavés sur la surface de la bague supérieure de 35 boîtes de Pétri mm. Préparer un plat à part de Pétri pour chaque culture tranche. Avant de commencer la procédure de tranchage tous les instruments non stériles, lames de rasoir, des lames vibratome, lunettes de couverture et autres matériels utilisés pour la procédure de tranche et la culture doivent être stérilisés. Vaporiser tout le matériel non stérile avec 70% d'éthanol. Exposer les instruments et les boîtes de Pétri graissé avec UV dans une hotte stérile pendant au moins 30 minutes d'exposition aux UV avant la culture. Dans le même temps, remplir un tube Falcon de milieu de culture de l'air-buffering (compter 1,2 ml de chaque culture; pour 8 cultures préparer ml de milieu par exemple 10) et ajouter fraîchement dégelé luciférine (0,1 M solution stock; Promega, Madison, WI) (10 à 10 uL luciférine ml de milieu; concentration finale 0,1 mM). La luciférine est sensible à la lumière et des solutions de stock à la fois et le milieu luciférine contenant doivent être protégés de la lumière. Placer le tube Falcon avec la luciférine-support dans un endroit sombre 36-37 ° C la chambre de chauffage. Le cas échéant, la luciférine peut aussi être ajouté directement dans les boîtes de culture au moment de la découpe. Si luciférine n'est pas ajouté, il n'y aura aucune réaction de la lumière entre la luciférase et la luciférine et donc pas de signal provenant du tissu. Après exposition aux UV, joindre une lame stérile à l'vibratome. 3. SCN Tranchage procédure La procédure suivante décrit le tranchage des adultes, généralement 2-4 mois vieux, C57/BL6 souris. S'il vous plaît noter: la procédure de découpage, ainsi que l'exposition de lumière de l'animal pendant la nuit, peut différentielle réinitialiser la phase de la SCN. Pour éviter cela, le découpage et la culture doit être effectuée pendant les heures de lumière, de préférence entre ZT 6-12, où aucune phase substantielle des changements dus à la procédure de produire 12. Si SCN doit être échantillonnée dans l'obscurité, 3.1 et 3.2 doivent être effectuées à la lumière rouge ou avec des lunettes de nuit pour éviter les décalages de phase induite par la lumière. Anesthésier la souris de préférence par isofluorane (Baxter) dans une glass chambre. Lorsque l'animal a perdu ses réflexes douleur (vérifiez en pinçant avec les ongles dans la patte), mais n'a pas encore arrêté de respirer (pour maintenir un approvisionnement en oxygène le plus longtemps possible), rapidement décapiter la tête avec une paire de ciseaux ou similaire. S'il vous plaît noter: dans certains pays CO 2 d'exposition (hypercapnie) est encore autorisée en tant que méthode d'anesthésie, bien qu'il ait été signalé à promouvoir l'anxiété des animaux. En outre, la dislocation cervicale peut être nécessaire avant la décapitation. S'il vous plaît suivez les législations locales en euthanasier les animaux. Retirez les yeux de la tête avec des ciseaux afin d'éviter la fatigue et l'excitation encore des nerfs optiques, qui peuvent endommager le SCN. Si encore attaché, retirez les vertébrés dernière cervicale avec des ciseaux, enlever la peau (figure 1a) et faire deux coupes avec une belle paire de ciseaux (pour ciseaux à iris par exemple), une coupe de chaque côté du crâne sur les côtés, rendant ainsi amovible "couvercle". Ouvrez le crâne avec un outil de micro-rongeur (fine paire de ciseaux de dissection peut aussi être utilisé sur une souris) et enlever tous les os jusqu'à la bulbes olfactifs peuvent être vus. La hausse du travail, jamais pressant le cerveau avec l'outil, afin de prévenir tout dommage sur le SCN ventrale (Fig 1b). Découpez soigneusement le nerf optique entre les bulbes olfactifs et les hémisphères utilisant des micro fines disséquer des ciseaux à ressort. Assurez-vous que le nerf est complètement coupé depuis l'étirement du nerf optique peut entraîner des dommages dans le SCN et les tranches de rupture. Tournez la tête en bas et de laisser le cerveau intact tomber (si elle est encore attachée au cerveau, d'autres nerfs crâniens peuvent avoir besoin d'être coupés caudale du nerf optique) dans un récipient (par exemple un plat en verre de Pétri ≈ 10 cm) rempli avec 50-100 mL HBSS froid permettant un refroidissement rapide du cerveau. Idéalement, les deux nerfs optiques doit rester intacte (figure 1c). Gardez le cerveau dans les 30-60 secondes HBSS pour s'assurer que le cerveau est refroidi. Utilisez une cuillère ou similaires et le lieu du cerveau réfrigérés, surface dorsale haut, sur une surface de coupe stérile (par exemple un couvercle en verre boîte de Pétri à l'envers). Afin de préparer une coupe coronale, faire une coupe perpendiculaire avec des lames de rasoir stérile ou scalpels entre les hémisphères cérébraux et le cervelet, supprimant ainsi le cervelet. Appliquer la superglue sur la plateforme sèches appartenant à la vibroslicer / vibratome. Ramassez le cerveau (hémisphères cérébraux, sans le cervelet et sans bulbes olfactifs) en insérant un dièse, une pince courbe dans la partie rostrale et sécher soigneusement hors de la HBSS sur un papier filtre stérile, tenant toujours le cerveau avec la pince. (Au lieu d'insérer une pince, un petit morceau de papier filtre stérile peut être utilisé pour attacher et le transfert du cerveau). Fixer les hémisphères sur la plateforme collés avec la pointe vers le haut et la surface ventrale rostrale plus proche de la lame de coupe. Fixez la plate-forme dans le support appartenant à la vibratome (par exemple de Campden Instruments, Royaume-Uni) et immédiatement le remplir avec du HBSS froid. Si la coupe perpendiculaire est faite correctement, les hémisphères devraient tenir debout offrant ainsi un bon angle nécessaire pour faire une coupe coronale contenant le SCN bilatérales. Afin d'atteindre la zone cible de SCN, commencez couper des sections plus épaisses (500-800 um) des hémisphères à une vitesse élevée ou maximale du vibratome. Déplacement de la lame peut être assez rapide au début, avant d'atteindre l'hypothalamus, mais devrait être ralenti lorsque le chiasma optique devient visible (haute fréquence de la lame vibrante et le mouvement lent diminue horizontalement dommages cellulaires au cours de tranchage, augmentant ainsi la viabilité tranche). Réduire les sections à 100 um quand le chiasma optique devient plus grande (plus large) et la commissure antérieure devient plus petit. Afin d'acquérir une partie mi-SCN, le travail vous-même "bas" (direction caudale) jusqu'à ce que les deux noyaux SCN commencent à apparaître. Une loupe peut être nécessaire pour visualiser les noyaux. S'il vous plaît noter: le SCN dans le cerveau de la souris est située à plus caudale du chiasma optique par rapport au cerveau de rat. Lorsque le niveau souhaité de SCN a été atteint (SCN sera à ce point apparaissent comme plus définis, ronds ou en forme de structures d'amande; 1d Fig; environ Bregma-0,46 à -0,70 mm pour la région centre du SCN chez la souris 13, Bregma – 0.92 à -1.40 mm pour le rat 14), couper la section SCN (figure 1E). Épaisseur convenable de la tranche est pour la souris 250 ± 50 um; pour le rat 350 ± 50 um. Utiliser une brosse douce, l'ascenseur et le transfert de la tranche SCN à un couvercle d'une boîte de Pétri remplie de taille moyenne avec HBSS froid, placé sous un microscope à dissection ou stéréoscope. Vérifiez si le sous grossissement SCN bilatérale est clairement visible. Si le milieu de la région du SCN sera choisi (qui peut ne pas nécessairement être le seul niveau "optimal" tranche mais que nous considérons est la meilleure façon de normaliser la procédure de découpage et de réduire les variations), il devrait être clairement visible au moins sur un côté de lala section tranche. Si la coupe était trop rostrale, faire une autre section et vérifiez la SCN sous grossissement. 4. Culture organotypique SCN Dans le couvercle boîte de Pétri remplie de HBSS, disséquer le SCN bilatéraux comme un tissu carré (~ 1,5 mm de chaque côté) avec une paire de scalpels stériles sous un microscope à dissection. Un petit morceau du chiasma optique restera attaché à l'explant, mais pas d'autres noyaux devraient être inclus. Couper le plus près possible sans enlever les tissus du RCS. Le cas échéant de l'expérience prévue, le SCN bilatérale peut alors être coupé en deux pour obtenir deux SCN unilatérale. Un SCN unilatérale peut alors être utilisé comme contrôle (figure 2a). Remplissez 1200 uL de la luciférine-support dans un plat à ≈ 35 mm de Pétri et placer une membrane de la culture (Milli-CM 0,4 um, Millipore, Bedford, MA) sur le dessus de la surface du liquide (2b). Le volume milieu de culture est cruciale, car la membrane de la culture doit s'asseoir solidement sur ​​la base de la boîte de culture, non pas flotter ou de roche dans le milieu 11. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air sous la membrane. Éviter l'exposition lumière inutile quand on travaille avec la luciférine. Les explants sont petites et difficiles à ramasser. Par conséquent l'utilisation d'une pipette 1000 uL + pourboire à sucer l'explant SCN dans la pointe et appuyez sur la membrane. Dans le cas de l'explant est trop grande pour s'intégrer facilement dans une pipette uL 1000 (SCN de rats, par exemple, et la souris SCN bilatéraux) de la pointe peut être coupé avec un outil stériles pour créer une ouverture plus large. Jeter HBSS excessive sur la membrane avec la pipette. Pour l'enregistrement de la luciférase, placer un seul SCN / plat (figure 2b) que les tubes d'enregistrement de détecter tous les photons émis par l'antenne et ne distinguent pas entre les signaux provenant de différents tissus. Sceller le plat avec un couvercle en verre (≈ 40 mm, Menzel-Glaser, Allemagne) et de la graisse à vide (Dow Corning Corp, USA) 11. Assurez-vous que le joint est serré (figure 2C). Si non, joint avec plus de graisse. Placer les boîtes dans une 36-37 ° C étanche à la lumière de chambre et de commencer PMT-enregistrements immédiatement. 5. Mesure de l'activité luciférase par bioluminescence enregistrement Signaux de bioluminescence luciférase induite par le tissu de petites SCN sont détectés et amplifiés avec photonmultiplier tube assemblées détecteur (PMT) monté à l'intérieur d'une chambre étanche à la lumière. Les PMT sont normalement positionnés ~ 1-2 cm au-dessus des 8 boîtes de culture. Configurations d'enregistrement PMT peuvent être fabriqués ou qui sont disponibles dans le commerce 11. Placer le plat sous un PMT (la chaleur produite à partir de la PMT va supprimer la condensation sur le couvercle en verre) et fermer la chambre. Assurez-vous que la chambre est de 100% étanche à la lumière que le nombre de sombres de PMT utilisée pour les tissus SCN est très faible (moins de 20 photons / min). Le PMT détecter même les fuites les plus faibles de lumière. Démarrer l'acquisition de données, qui est réalisée avec le logiciel (pour LumiCycle exemple; Actimetrics Inc, Wilmette, Illinois, USA). Compte Photon sont intégrés sur des intervalles de 10 à 10 min pour obtenir la résolution élevée de l'expression des gènes / protéines. Après l'enregistrement est terminé, l'expression obtenue circadienne du gène / protéine peut être analysé avec un logiciel approprié (Origine, OriginLab, Northampton, MA, USA; ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono, Till Roenneberg de l'Université de Munich, Munich, Allemagne) pour déterminer la phase, la période (le temps pour un cycle) et l'amplitude du rythme. Le pic de l'expression des gènes ou de protéines est surtout utilisé comme point de référence et est défini comme le nombre le plus élevé de photons pendant un cycle. Les données peuvent être lissés avant les analyses de la phase, la période et d'amplitude, surtout si le rapport signal / bruit est faible. La ligne de base, parfois des changements et doivent être soustraites avant les analyses sont effectuées. 6. Les résultats représentatifs: Nous présentons ici l'PER2 oscillatoires:: expression LUC comme une lecture de la viabilité et l'état des cultures de tissus. Dans des conditions optimales, et si le tissu est vivant, le PER2:: expression LUC oscille avec un rythme circadien comme le montre la figure 3. PER2 dans le SCN est au maximum exprimé généralement autour de l'heure zeitgeber 12-13 (où 12 représente ZT feux éteints dans une 12:12 h lumière: obscurité de cycle). La plus grande taille le tissu vivant est élevé, plus le nombre de photons devient. Toutefois, la taille et l'épaisseur des tissus cultivés organotypically doit rester faible afin de maintenir le tissu viable, de préférence pas plus de 15 mm 2 11 et non plus épais de 500 um 7. Le SCN, si disséqué comme décrit ici, montre généralement compte photons entre 10.000-40.000/min si le tissu est prélevé à partir d'un PER2 homozygote:: animaux LUC. L'amplitude de l'oscillation dans les cultures organotypiques SCN est généralement très élevé durant le premier cycle par rapport aux cycles suivants. Il n'est pas très bien pourquoi le premier cycle a amplit très élevéUde. Une explication possible est qu'une partie importante de cellules dans les tissus peuvent mourir peu de temps après la coupe initiale et de culture, donc pas en utilisant la luciférine après le premier cycle. La procédure de coupe peuvent également provoquer une excitation excessive, ce qui pourrait amplifier le signal luciférase cours du premier cycle. La figure 3 montre des traces de luminescence à partir de tranches SCN et contient une trace (en rouge) obtenues à partir d'un morceau qui n'était pas initialement en bonne santé. Tissus morts ou insalubres ont de faibles bases comptent photon. (En outre, les tissus morts souvent dissocier dans le plat et ne peuvent pas être retirés de la membrane en un seul morceau.) La technique décrite dans ce rapport peuvent être avantageusement utilisées dans des expériences pharmacologiques. La figure 4 montre une trace d'une culture qui nous avons traité entre le jour 1 et 2 avec un bloqueur des canaux HCN (ZD7288, 10 uM). Comme on peut le voir sur la figure et tel que publié antérieurement 15, le bloqueur considérablement réduit l'amplitude de l'oscillation circadienne de PER2; cependant, après un lavage avec un milieu de culture normale de l'oscillation est revenu, prouvant que le bloqueur affecté l'horloge moléculaire, mais le tissus était viable et sain. Figure 1. Tranchage procédure A) La tête d'une souris euthanasiées décapité avec les yeux et la peau enlevée. B) Le crâne est enlevée avec un outil de micro-rongeur. Lorsque vous utilisez l'outil, il faut travailler à la hausse et jamais appuyer le cerveau avec l'outil. C) Le cerveau montre l'envers (face ventrale) sans bulbes olfactifs. Le chiasma optique blanche avec les deux intacts les nerfs optiques peuvent être vus. Le noyau suprachiasmatique (NSC, les frontières marqués en rouge) est situé à proximité du chiasma optique. D) Un cerveau coupé coronaire attaché à la plate-forme dans le vibroslicer, au niveau de la SCN. E) la section du cerveau coronale (250 um d'épaisseur) contenant le chiasma optique (CO), le troisième ventricule (3V) et les noyaux bilatéraux suprachiasmatique (NSC). Figure 2. Culture de tissus organotypiques. A) Les deux noyaux SCN unilatérale (insert) disséqué de la tranche indiquée. B) boîte de culture (35 mm boîte de Petri) avec membrane de la culture, à moyen et expiant, mais sans graisse à vide et le couvercle en verre. Le milieu (1,2 ml) peut être considérée comme liquide entre le plat et la membrane. Un noyau SCN unilatérale est placé sur la membrane de la culture. The Whitest partie du tissu de petites est un morceau du chiasma optique (insert). C) La boîte de culture avec sa membrane et son tissu SCN, scellé avec de la graisse à vide et un couvercle en verre rond. Figure 3. Enregistrements de bioluminescence sain et non des cultures de tissus sains du RCS. Exemples d'enregistrements de la période2 bioluminescence: la luciférase (PER2:: LUC) expression dans le noyau suprachiasmatique (NSC) tranches obtenues chez la souris dans un lieu à 12h: 12h de lumière: obscurité de cycle. Le PER2:: protéines LUC oscille avec une circadien (~ 24 h) la variation dans laquelle l'expression maximale de la protéine se produit au moment zeitgeber 12-13. Ainsi, la phase du rythme gène est dépendant de l'horaire de lumière noire dans laquelle l'animal a été conservé avant sacrifié. Typiquement, la bioluminescence des tissus disséqués SCN unilatérale telle que décrite dans le protocole présente les chiffres de photons entre ~ 10.000-40.000/minute. La figure montre des traces d'une culture saine SCN (noir), une culture SCN non sains (rouge) et une culture que les SCN séché (en bleu) après l'ouverture de la boîte de culture scellées au jour 4 et non re-sceller le plat correctement ( indiqué par la flèche). Figure 4. L'enregistrement bioluminescence pendant et après l'exposition au médicament. PER2:: expression LUC dans une culture avant, pendant et après l'action d'un bloqueur de canal HCN (ZD7288, 10 uM). La première flèche indique le moment où le dresseur a été ajouté. La deuxième flèche indique lavage, ce qui a été faite en remplaçant le médicament contenant un milieu avec des moyennes de contrôle conditionné. Notez l'amplitude réduite après 2 jours d'exposition au médicament, le manque d'oscillation à jour 4 et le rétablissement rapide du rythme de la protéine après lavage.