Slice Voorbereiding, organotypische Tissue kweken en Luciferase Opname van Klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern

1. Bereiding van oplossingen Kweekmedium met air-buffercapaciteit Vul een 1 liter fles met circa 800 ml steriele H 2 O (geautoclaveerd milliQ H 2 O). Tijdens het roeren, toevoegen en mengen volgende stoffen: een container lage glucose, serum-vrij DMEM 2902 poeder zonder natriumbicarbonaat en fenol rood (fenol rood interfereert met de bioluminescentie signaal), 20 ml B27 supplement 50x, 4,7 ml van een 7,5% NaHCO 3 oplossing (of 0,35 g NaHCO 3), 10 ml HEPES 1M, 2,5 mL Penstrep 10.000 U / ml en 3,5 g D-glucose. Laat het medium roer tot de ingrediënten zijn volledig is opgelost. Het uiteindelijke medium (1 liter) zal bevatten: 1x DMEM, 1x B27 supplement, 4,2 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 25 U / ml penicilline, 25 U / ml streptomycine en 19 mM D-glucose. Breng de pH tot 7,2, met behulp van NaOH te verlagen of HCl om de pH te verhogen, en het volume aan te passen aan 1 liter met steriele H 2 O. Pas osmolaliteit met H 2 O (afname osmolaliteit) of D-glucose (toename osmolaliteit). De osmolaliteit moet tussen de 285-315 mOsm / kg, maar het optimale bereik is 300 tot 310 mOsm / kg. Niet om het medium meer dan 5% te verdunnen. Filter het kweekmedium met behulp van Corning steriele vacuümfiltratie sets (bijv. 2 x 500 ml met een poriegrootte 0,22 pm) in een steriele kap. Houd het medium in 4 ° C en beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie. Wij raden aan dat het medium wordt gebruikt binnen 3 maanden. Gebalanceerde zout Hank's oplossing (HBSS) buffer met supplementen (voor het snijden van plakken) Vul een 1 liter glazen fles met ~ 600 ml steriele (geautoclaveerd milliQ) H 2 O en voeg de volgende stoffen: 100 ml HBSS 10x voorraad, 10 ml penicilline-streptomycine 10.000 E / ml, 5 ml van een 7,5% NaHCO 3 oplossing en 10 ml HEPES 1M. De uiteindelijke snij-oplossing zal bevatten: 1x HBSS, 10 mM HEPES, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / ml penicilline en 100 U / ml streptomycine. Controleer de pH en, indien nodig, de pH instellen op 7,2 en breng het volume tot 1 liter met steriele H 2 O. Controleer osmolaliteit, die moet worden tussen de 285 tot 315 mOsm / kg. Koel de HBSS tot 4 ° C. De HBSS buffer moet zeer koud (4 ° C) tijdens het snijden / knippen procedure om naar beneden te brengen van de stofwisseling en het behoud van levensvatbaarheid van het weefsel. 2. Voorbereidingen voor het snijden en het kweken Slices De weefsels worden gekweekt in een warme droge kamer zonder CO 2. Om te voorkomen dat uitdroging de culturen moeten worden afgedicht met deksel bril bevestigd aan de gerechten door vet. Voor dit doel, vul dan 5 ml spuiten met siliconen op basis van vacuüm vet. Bedek de spuit tips met kleine stukjes aluminiumfolie en autoclaaf ze. Ook autoclaaf papieren filters (gebruikt tijdens het snijden procedure). Vlak voor het snijden van de procedure, van toepassing geautoclaveerd vacuum vet op de bovenste ring oppervlak van 35 mm petrischaaltjes. Maak een aparte petrischaal voor elk segment cultuur. Voordat u begint met het snijden van de procedure alle niet-steriele instrumenten, scheermesjes, vibratome bladen, dekglaasjes en ander materiaal dat wordt gebruikt voor het segment en de cultuur procedure moeten worden gesteriliseerd. Spray alle niet-steriele apparatuur met 70% ethanol. Expose de instrumenten en de ingevette petrischaaltjes met UV in een steriele kap voor ten minste 30 minuten blootstelling aan UV voor de kweek. Op hetzelfde moment, vul een Falcon buis met lucht-buffering kweekmedium (count 1,2 ml voor elke cultuur, voor 8 culturen voor te bereiden op bijvoorbeeld 10 ml medium) en voeg vers ontdooide luciferine (0,1 M voorraadoplossing, Promega, Madison, WI) (10 pL luciferine tot 10 ml medium; uiteindelijke concentratie 0,1 mM). De luciferine is lichtgevoelig en zowel de voorraad oplossingen en de luciferine-bevattend medium moeten worden beschermd tegen licht. Plaats de Falcon buis met luciferine-medium in een donkere 36-37 ° C verwarmen kamer. Indien nodig, kan de luciferine ook direct worden toegevoegd aan de cultuur gerechten op het moment van snijden. Als luciferine wordt niet toegevoegd, zal er geen licht reactie tussen luciferase en luciferine en dus geen signaal van het weefsel. Na blootstelling aan UV, bevestig een steriel mes op de vibratome. 3. SCN Snijden Procedure De volgende procedure beschrijft het snijden van volwassen, meestal 2-4 maanden oud, C57/BL6 muizen. Let op: de snij-procedure, evenals de blootstelling aan licht van het dier 's nachts, kan differentieel reset de fase van de SCN. Om dit te voorkomen moet het snijden en het kweken worden uitgevoerd tijdens de licht uren, bij voorkeur tussen ZT 6-12, wanneer er geen wezenlijke fase verschuivingen als gevolg van de procedure plaatsvinden 12. Als SCN moet worden bemonsterd in de duisternis, 3.1 en 3.2 moeten worden uitgevoerd in rood licht, of met nachtkijkers aan het licht-geïnduceerde fase-verschuivingen te voorkomen. Bij voorkeur verdoven de muis door isofluorane (Baxter) in een GLAss kamer. Wanneer het dier zijn pijn reflexen (controleren door te knijpen met de nagels in de poot) verloren, maar is nog niet gestopt met ademen (om zuurstof te houden zo lang mogelijk), snel onthoofden het hoofd met een schaar of iets dergelijks. Let op: in sommige landen CO 2 blootstelling (hypercapnie) is nog steeds toegestaan ​​als verdovingsmiddel methode, hoewel het is gemeld aan dier-angst te bevorderen. Daarnaast kunnen cervicale dislocatie nodig zijn voor de onthoofding. Volg de plaatselijke wetgeving als euthanasie dieren. Verwijder de ogen van het hoofd met een schaar om de spanning en de verdere prikkeling van de optische zenuwen, die de SCN kan schade te voorkomen. Indien nog steeds verbonden, verwijder de laatste cervicale gewervelde met een schaar, verwijder de huid (afb. 1a) en maak twee sneden met een fijne schaar (bijvoorbeeld iris schaar), een afgesneden aan elke kant van de schedel langs de zijkanten, waardoor een verwijderbaar "deksel". Open de schedel met een micro rongeur tool (fijn ontleden van een schaar kan ook gebruikt worden op een muis) en verwijder alle bot tot de olfactorische lampen kan worden gezien. Het werk naar boven, nooit te drukken de hersenen met de tool, om beschadiging van de ventrale SCN (afb. 1b) te voorkomen. Knip voorzichtig de oogzenuw tussen de olfactorische bollen en de hemisferen met behulp van fijne micro ontleden voorjaar schaar. Zorg ervoor dat de zenuw volledig is afgesneden, omdat die zich uitstrekt van de oogzenuw kan leiden tot schade aan de SCN en gescheurde plakjes. Draai het hoofd ondersteboven en laat de intacte hersenen eruit vallen (indien nog aan de hersenen, andere hersenzenuwen kan nodig zijn om caudaal worden gesneden om de oogzenuw) in een container (bijvoorbeeld een glazen petrischaal ≈ 10 cm) gevuld met 50-100 ml koud HBSS, waardoor een snelle afkoeling van de hersenen. Idealiter zou de twee oogzenuwen blijven intact (afb. 1c). Houd de hersenen in de HBSS 30-60 seconden om ervoor te zorgen dat de hersenen gekoeld. Gebruik een lepel of dergelijke en plaats de gekoelde hersenen, dorsale oppervlak tot op een steriele snij-oppervlak (bijvoorbeeld een glazen petrischaal deksel op zijn kop zette). Met het oog op een coronale snede te bereiden, maak een loodrechte snede dicht met steriele scheermesjes of scalpels tussen de hersenhelften en de kleine hersenen, waardoor het verwijderen van de kleine hersenen. Toe te passen secondelijm op de droge-platform die behoren tot de vibroslicer / vibratome. Pak de hersenen (hersenhelften zonder cerebellum en zonder olfactorische gloeilampen) door het invoegen van een scherpe, gebogen tangen in de rostrale deel en voorzichtig droog uit de HBSS op een steriele filter papier, nog steeds de hersenen met de tang. (In plaats van het invoegen van een pincet, een klein stukje van de steriele filter papier kan worden gebruikt voor het bevestigen en overdracht van de hersenen). Bevestig de hersenhelften op de gelijmde platform met de rostrale tip omhoog en ventrale oppervlak het dichtst bij de mes. Bevestig het platform in de houder die behoren tot de vibratome (bijvoorbeeld uit Campden Instruments, Verenigd Koninkrijk) en onmiddellijk vul het met koud HBSS. Als de loodrechte snede correct zijn, moet de hemisferen rechtop staan ​​en zo een goede hoek nodig zijn voor het maken van een coronale snede met de bilaterale SCN. Met het oog op het doel SCN gebied te bereiken, start het afsnijden van dikkere secties (500-800 um) van de hersenhelften bij hoge of een maximale snelheid van de vibratome. Verplaatsen van het blad kan vrij snel in het begin voor het bereiken van de hypothalamus, maar moeten worden vertraagd wanneer de optische chiasma zichtbaar (hoge frequentie van de trillende blad en langzame beweging horizontaal neemt celbeschadiging tijdens het snijden, waardoor slice levensvatbaarheid). Verminder de secties tot 100 urn wanneer de optische chiasma wordt groter (breder) en de voorste commissura kleiner wordt. Met het oog op een mid-SCN sectie verwerven, werk zelf "down" (caudale richting) tot aan de twee kernen SCN beginnen te verschijnen. Een vergrootglas kan nodig zijn voor het visualiseren van de kernen. Let op: de SCN in de hersenen van muizen ligt meer caudaal van de optische chiasma ten opzichte van de hersenen van de rat. Wanneer het gewenste niveau van SCN is bereikt (de SCN zal verschijnen op dit punt meer gedefinieerd, rond of amandelvormig structuren; figuur 1d, ongeveer Bregma-+0,46–0,70 mm voor het centrum gebied van de SCN in muis 13, Bregma – +0,92 tot -1,40 mm voor rat 14), knip de SCN sectie (afb. 1e). Geschikte dikte van het schijfje is voor muis 250 ± 50 micrometer, voor rat 350 ± 50 um. Met een zachte borstel, een lift en overdracht van de SCN slice om een ​​deksel van een middelgroot petrischaal gevuld met koud HBSS, geplaatst onder een microscoop of dissectie stereoscoop. Controleer onder vergroting of de bilaterale SCN is duidelijk zichtbaar. Als het midden van de regio van de SCN zal worden gekozen (die niet noodzakelijkerwijs de enige "optimale" slice-niveau, maar dat we overwegen is de gemakkelijkste manier om het snijden procedure te standaardiseren en te verminderen variatie), moet het duidelijk te zien op zijn minst op de ene kant van deslice sectie. Als de cut was te rostraal, maak een andere sectie en controleren op de SCN onder vergroting. 4. Organotypische SCN Cultuur In de petrischaal deksel gevuld met HBSS, ontleden de bilaterale SCN als een vierkant weefsel (~ 1.5 mm aan iedere kant) met een paar steriele scalpels onder een dissectie microscoop. Een klein stukje van de optische chiasma zal gehecht blijven aan de explantatie, maar geen andere kernen moeten worden opgenomen. Snijd zo dicht mogelijk zonder het verwijderen van SCN weefsel. Indien van toepassing voor de geplande experiment, kan de bilaterale SCN dan worden gehalveerd tot twee eenzijdige SCN te verkrijgen. Een eenzijdige SCN kan dan worden gebruikt als controle (afb. 2a). Vul 1200 pi van de luciferine-medium in een ≈ 35 mm petrischaal en plaats een cultuur membraan (Milli-CM 0,4 micrometer, Millipore, Bedford, MA) op de top van het vloeistofoppervlak (2b). Het kweekmedium volume is van cruciaal belang, omdat de cultuur membraan moet goed zitten op de basis van de cultuur schotel, niet zweven of steen in het medium 11. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het membraan. Vermijd onnodige blootstelling aan licht bij het werken met luciferine. De explantaten zijn klein en moeilijk te halen. Daarom gebruik maken van een 1000 pi pipet + tip voor de SCN explantatie zuigen in de punt en druk de op het membraan. In het geval de explantatie is te groot om gemakkelijk in een 1000 pi pipettip (bv. rat SCN, en de muis bilaterale SCN) de tip kan worden gesneden met een steriel hulpmiddel om een ​​bredere opening creëren. Gooi overmatige HBSS op het membraan met de pipet. Voor het opnemen van luciferase, plaats maar een SCN / schotel (afb. 2b) als de opname buizen detecteren alle fotonen die uit de schotel en geen onderscheid maken tussen signalen van verschillende weefsels. Sluit de schotel met een deksel glas (≈ 40 mm, Menzel-Glaser, Duitsland) en vacuüm vet (Dow Corning Corp, USA) 11. Zorg ervoor dat de afdichting strak is (afb. 2c). Zo niet, afdichting met meer vet. Breng de schalen in een 36-37 ° C lichtdichte kamer en direct aan de slag PMT-opnames. 5. Meting van luciferase-activiteit door de Recording Bioluminescentie Luciferase-geïnduceerde bioluminescentie signalen van de kleine SCN weefsel worden gedetecteerd en versterkt met photonmultiplier-tube (PMT) detector assemblages gemonteerd in een lichte strakke kamer. De PMT's zijn normaal gepositioneerd ~ 1-2 cm boven de cultuur gerechten 8. PMT opname instellingen kunnen op maat worden gemaakt of zijn commercieel verkrijgbaar 11. Zet de schaal in een PMT (de warmte die uit de PMT zal condensatie te verwijderen op de cover glas) en sluit de kamer. Zorg ervoor dat de kamer is 100% licht-strak als de donkere graaf van PMT's gebruikt worden voor SCN weefsels is zeer laag (minder dan 20 fotonen / min). De PMT's detecteren, zelfs de zwakste licht lekkage. Start de data-acquisitie, die wordt uitgevoerd met software (bijvoorbeeld LumiCycle, Actimetrics Inc, Wilmette, IL, USA). Foton telt zijn geïntegreerd over 10-10 min interval een hoge resolutie van het gen / eiwit expressie te krijgen. Nadat de opname is voltooid, kan de verkregen circadiane expressie van het gen / eiwit geanalyseerd worden met de juiste software (Origin, OriginLab, Northampton, MA, Verenigde Staten, ClockLab, Actimetrics, LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono, Till Roenneberg, Universiteit van München, München, Duitsland) naar fase, periode (tijd voor een cyclus) en de amplitude van het ritme te bepalen. De piek expressie van gen-of eiwit wordt meestal gebruikt als referentiepunt en wordt gedefinieerd als de hoogste foton telling gedurende een cyclus. De gegevens kunnen worden gladgestreken voordat analyses van fase, periode en amplitude, vooral als de signaal / ruis-verhouding laag is. De baseline soms veranderingen en moeten worden afgetrokken voordat de analyses worden uitgevoerd. 6. Representatieve resultaten: Wij hier presenteren de oscillerende PER2:: LUC expressie als een uit te lezen voor de levensvatbaarheid en de toestand van de gekweekte weefsel. Onder optimale omstandigheden, en als het weefsel leeft, de PER2:: LUC expressie oscilleert met een circadiaan ritme, zoals aangegeven in figuur 3. PER2 in de SCN is maximaal typisch uitgedrukt rond Zeitgeber Tijd 12-13 (waar ZT 12 vertegenwoordigt lichten uit in een 12:12 uur licht: donker cyclus). Hoe groter in omvang het levend weefsel is, des te hoger het foton tellen wordt. Echter, de grootte en dikte van organotypically gekweekte weefsel worden klein gehouden in stand te houden het weefsel levensvatbaar, bij voorkeur niet groter dan 15 mm 2 11 en niet dikker dan 500 micrometer 7. De SCN, indien ontleed zoals hier beschreven, meestal laat foton telt tussen 10.000-40.000/min als het weefsel wordt bemonsterd uit een homozygote PER2:: LUC dier. De amplitude van de trilling in organotypische SCN culturen is meestal zeer hoog tijdens de eerste cyclus in vergelijking met de volgende cycli. Het is niet geheel duidelijk waarom de eerste cyclus zeer hoge Verst heeftUde. Een mogelijke verklaring is dat een aanzienlijk deel van de cellen in het weefsel kort kunnen sterven na de eerste snijden en kweken, dus niet gebruik te maken van luciferine na de eerste cyclus. Het snijden procedure kan ook leiden tot excessieve excitatie, die het luciferase signaal tijdens de eerste cyclus zou kunnen versterken. Figuur 3 toont luminescentie sporen van SCN plakken en bevat een trace (rood), verkregen uit een plakje dat niet was in eerste instantie gezond. Dood of ongezond weefsels hebben een laag foton tellen basislijnen. (Daarnaast, dode weefsels vaak dissociëren in de schaal en kan niet worden verwijderd van het membraan in een stuk.) De techniek wordt beschreven in dit rapport kan heilzame worden gebruikt in farmacologische experimenten. Figuur 4 toont een spoor van een cultuur die we tussen dag 1 en 2 behandeld met een HCN-blokker (ZD7288, 10 uM). Zoals te zien is in de figuur en zoals eerder 15 gepubliceerd, de blocker aanzienlijk verminderd de amplitude van de circadiane oscillatie van PER2, maar na het wassen met een normale kweekmedium de oscillatie kwam terug, waaruit blijkt dat de blocker de moleculaire klok getroffen, maar de weefsel was levensvatbaar en gezond. Figuur 1. Het snijden van de procedure A) Het hoofd van een onthoofde muis gedood met de ogen en de huid verwijderd. B) De schedel wordt verwijderd met een micro rongeur tool. Bij gebruik van het gereedschap, moet men naar boven te werken en nooit druk de hersenen met de tool. C) De hersenen zijn kop afgebeeld (ventrale zijde naar boven) zonder olfactorische lampen. De witte optische chiasma met de twee intacte oogzenuwen kan worden gezien. De suprachiasmatische kern (SCN, de grenzen gemarkeerd met rood) ligt dicht bij de optische chiasma bevindt. D) een coronaalwaarts gesneden hersenen verbonden aan het platform in de vibroslicer, op het niveau van SCN. E) coronale hersenen sectie (250 um dik) met de optische chiasma (OC), derde ventrikel (3V) en de bilaterale suprachiasmatische kernen (SCN). Figuur 2. Organotypische weefsel kweken. A) De twee eenzijdige SCN kernen (insert) ontleed van de slice getoond. B) Cultuur schaal (35 mm petrischaal) met cultuur membraan, medium en explantatie, maar zonder vacuum vet en dekglas. Het medium (1,2 ml) kan gezien worden als vloeistof tussen de schotel en het membraan. Een eenzijdige SCN kern is geplaatst op de cultuur membraan. De witste deel van de dunne weefsel is een stuk van de optische chiasma (insert). C) De cultuur schotel met haar membraan en de SCN weefsel, verzegeld met vacuüm vet en een ronde deksel glas. Figuur 3. Bioluminescentie opnames van gezonde en niet-gezond SCN weefsel culturen. Voorbeelden van bioluminescentie opnames van periode2:: luciferase (PER2:: LUC) uitdrukking in suprachiasmatische nucleus (SCN) plakken verkregen van muizen die in een 12u: 12u licht: donker cyclus. De PER2:: LUC eiwit oscilleert met een circadiane (~ 24 uur) variatie, waarin de maximale expressie van het eiwit plaatsvindt op Zeitgeber moment 12-13. Zo is de fase van het gen ritme is afhankelijk van de licht-donker schema waarin het dier werd gehouden voor opgeofferd. Typisch, bioluminescentie van eenzijdige SCN weefsel ontleed zoals beschreven in het protocol laat zien foton telt tussen ~ 10.000-40.000/minute. De figuur toont sporen van een gezonde (zwart) SCN cultuur, een niet-gezonde SCN cultuur (rood) en een SCN-cultuur, die uitgedroogde (blauw) na het openen van de verzegelde cultuur schotel op dag 4 en niet opnieuw het afdichten van de schotel goed ( aangegeven met pijl). Figuur 4. Bioluminescentie opnemen tijdens en na de blootstelling aan het geneesmiddel. PER2:: LUC expressie in een cultuur voor, tijdens en na de actie van een HCN-blokker (ZD7288, 10 uM). De eerste pijl geeft het moment dat de blocker werd toegevoegd. De tweede pijl geeft wash-out, die werd gemaakt door de vervanging van het geneesmiddel bevattend medium met geconditioneerde controle medium. Let op de lagere amplitude na 2 dagen van blootstelling aan het geneesmiddel, het ontbreken van de trilling op dag 4 en de snelle herstel van het eiwit ritme na de wash-out.