Развитие Отрицательные Маркер для выбора Entamoeba histolytica</em

1. FCU Отрицательные Выбор системы в Entamoeba histolytica Линии векторного управления (HM1 / pKT3M) и экспериментальной линии (HM1/pKT3M-FCU1) были сгенерированы ранее описанных 1,2 техник. Семенной линий при исследовании со склада трубы в Т-25 колб и поддерживать выбор, добавив соответствующий антибиотик (12 мкг / мл G418) в Tyi-S-33, 3 средних. Колбы должна быть 70-80% сливной после 16-18 часов роста при 37 ° C. Подготовка свежей 50 мМ маточного раствора из 5-Fluorocytosine (5-FC, Sigma) в теплой Tyi-S-33 среды. Vortex строго в течение нескольких минут, чтобы растворить 5-ФК полностью. Фильтр-стерилизовать маточного раствора, пропуская ее через фильтр 0,22 мкм. Урожай трофозоиты путем размещения колбы на льду в течение 3-5 минут и сбора клетки центрифугированием при 200xg в течение 5 минут при комнатной температуре. Ресуспендируют пеллет в свежую среду Tyi и считать клетки. Дизайн типичном эксперименте используется 0,5 х 10 4 клеток на лунку 48-луночного планшета в конечном объеме 1 мл, и трижды повторяется для каждого теста состоянии. Кроме того, для облегчения флуоресцентных измерений, отдельная пластина используется для каждого штамма на момент времени. Семенной 0,5 х 10 4 клеток на лунку для каждого теста 5-ФК концентрации, в трех экземплярах. Поддержание давления отбора антибиотика в среде Tyi. Теперь добавьте необходимое количество 5-ФК маточного раствора и трофозоиты в каждую лунку. Инкубируйте пластин в анаэробных мешок при температуре 37 ° C. 2. Определение эффективности выбора Подготовка 2 мг / мл исходного раствора сотовый трекера зеленые CMFDA (Invitrogen) в ДМСО. Чтобы сделать рабочий раствор разбавить акции в 1000 раз в бессывороточной среде Tyi. Удалить среду полностью из трофозоит пластин культуры и заменить 150 мкл бессывороточной Tyi содержащие CMFDA. Продолжить инкубации при температуре 37 ° С в течение 1 часа. Удалить раствор красителя из колодцев и читать пластины в spectrofluorometer Spectramax М2 планшет. Длины волны возбуждения должна быть установлена ​​на 492 нм и флуоресценции выбросов читать на 517 нм. Сравните флуоресценции значения для контрольных клеток по сравнению с тест трансфектантов. Продолжить чтение пластин на каждом временном интервале. Используйте соответствующие положительные (Tyi только) и отрицательные (25 мкг / мл гигромицину) контроль скважин в каждую тарелку. 3. Представитель Результаты E. histolytica трансфектантов показал надежную выражение кодон оптимизированы рекомбинантный FCU1 (рис. 1). При этом протоколе следует правильно это приводит к селективной ликвидации Е. histolytica клеток, экспрессирующих FCU1 в присутствии 0,5 мМ 5-fluorocytosine. Управление клетки, в отличие продолжают нормально расти со скоростью до 5 мМ концентрация 5-ФК и достичь слияния между 72 и 96 часов (рис. 2-а). FCU1 проведения клеток на 48 часов полностью лизируются при обработанных скважин рассматриваются под микроскопом. Они также показывают, снизилась флуоресценции при окраске жизненно красителя CMFDA, который используется в количественных исследований с участием большого количества образцов (рис. 2-б). FCU1/5-FC система эффективный и мощный отрицательный выбор инструмента для E. histolytica трофозоиты. Рисунок 1. Генерация Е. histolytica HM1 трансфектантов выражения отрицательных селективного маркера () FCU1 рекомбинантный белок был обнаружен на западном пятно с использованием анти-Myc с антителом (верхняя часть). Как и ожидалось, 42kDa группа могла быть обнаружена (показан стрелкой) в общем лизат из трансфектантов FCU, но не в один вектор управления трансфектантов. Нижняя панель показывает то же самое пятно исследовали с антителами анти актина в качестве управления загрузкой. (Б) Результаты количественной ПЦР в реальном времени показывает выражение FCU1 конкретные мРНК нормированная на lgl4 контроля. Рисунок 2. Экстракорпоральное лекарственной чувствительности Е. histolytica трансфектантов выражения отрицательных селективного маркера Кривые выживаемости (а) контроль трансфектантов и (б) FCU1 выражения трансфектантов культивировали в 48-луночного планшета. Клетки, выращенные в присутствии увеличивающихся концентраций пролекарство-5-fluorocytosine; выживаемость клеток была количественно окрашиванием CMFDA на каждом временном интервале, как обозначается на оси абсцисс. Y-ось представляет флуоресценции единиц и является прямым отражением выживания клеточной популяции. Обратите внимание, что FCU1 выражения трансфектантов показали значительное чувствительности при концентрации 0,5 пролекарство по сравнению с контролем. Нет клетки были обнаружены в момент времени 120 часов в этих скважинах по сравпо сравнению с сплошной рост видели в соответствующие лунки контроль под микроскопом (данные не приведены). Гигро обозначает 25μg / мл гигромицину использовать в качестве отрицательного контроля.