La cultura del motore principale e neuroni sensoriali in Media definiti in elettrofilate Poli-L-lactide Ponteggi nanofibre

1. Poli-L-lattico (PLLA) Spinning Soluzione Sciogliere 0,4 g PLLA in 9 ml di cloroformio, mescolando a fuoco basso. Aggiungere 1 ml di dimetilformammide alla soluzione, portando la concentrazione finale della soluzione al 4% PLLA (w / v) in cloroformio: DMF 9:1 (v / v). Mettere la soluzione in un polipropilene o siringa di vetro con una punta metallica smussata 23ga. 2. Filatura di preparazione del substrato 1 Preparare una soluzione 8% (w / v) di 85:15 PLGA (poli-lattico-co-glicolico acido) in cloroformio, agitando a fuoco basso. Cappotto pulito copertura in vetro scivola in PLGA coprendo la superficie di ogni vetrino con la soluzione di PLGA. Lasciare che il PLGA asciugare per un film sottile (ca. 30 min). 3. Electrospinning 2 Assicurare copertura in vetro rivestito PLGA scivola al collettore con nastro di carbonio conduttivo. Per le fibre allineate, il collettore è un motore ruota. Per le fibre di casuale, il collettore è un piatto fisso. Luogo in pompa siringa con punta 20 cm dalla ruota collettore. Set pompa per circa 2 ml / ora e se si utilizza una ruota, impostare il motore a 300-400 giri al minuto. Se possibile, applicare un -2 kV polarizzazione CC al collettore e 15 kV a punta in metallo. In assenza di accesso ad una alimentazione bipolare, a terra il collettore. Le fibre si getto dalla punta della siringa e raccogliere sulla ruota in movimento. Continuare a girare solo quando la densità desiderata delle fibre si ottiene. Strisciare la punta di metallo con un tovagliolo di carta, apposto su un non conduttivo asta periodicamente per evitare l'intasamento sulla punta. 4. Moating 1 A seguito di filatura, 'fossato' i campioni elettrofilate pipettando una linea di PLGA intorno al perimetro dello slip cover. Lasciare che il PLGA ad asciugare. Esso deve mantenere l'allineamento delle fibre durante cultura. 5. Proteina di rivestimento Elettrofilate fibre di vetro e controlli devono essere rivestiti di proteine ​​prima di colture cellulari. Coprire i substrati in una soluzione proteica per almeno un'ora e poi aspirare la soluzione in eccesso e proseguire fino a quando i substrati aspirazione sono a secco. Le soluzioni possibili sono le proteine: PLL (poli-L-lisina) (100 mg / ml), laminina (25 mg / ml) o fibronectina (50 mg / mL). Se il PLL è usato, i substrati devono essere risciacquati in acqua sterile e asciugati due volte dopo il rivestimento iniziale. 6. E15 ottenere embrioni di ratto 3 * Tutti gli esperimenti sono stati fatti in conformità con la Guida NIH per la cura e dell'uso degli animali da laboratorio come approvato dalla University of Michigan Commissione Uso e cura degli animali. Preparazione: Verificare se l'animale è incinta. Scongelare 3 mL tripsina, 3 FBS ml e una bottiglia di caldo L15. Fuoco lucidare una pipetta Pasteur. Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% per 30 min. Preparare e caldo terreni in piastra (vedi tabella 1). Eutanasia: eseguire un'iniezione IP di ketamina / xylazina. Attendere 10-15 minuti e controllare per mancanza di riflessi corneale e pedale ritiro. Una volta che i riflessi sono assenti, eseguire una iniezione di pentobarbital IC (FatalPlus). Tenda la pelle dell'addome. Tagliare attraverso la pelle e dei muscoli per esporre la cavità addominale. Individuare l'utero e staccarlo al collo dell'utero e delle ovaie. Rimuovere gli embrioni dall'utero con le forbici e metterli immediatamente in caldo L15. (Tutte le procedure che seguono sono maturati nell'ambito di un microscopio da dissezione e gli embrioni ei cavi sezionato deve essere immerso in acqua calda L15 in ogni momento.) Decapitare il embrioni chiudendo pinza intorno al mento e sotto l'osso occipitale del cranio. 7. Dissezione 3 Posizionare l'embrione su un lato. Proteggere il midollo spinale con un set di pinze mentre si utilizza l'altro insieme a spogliare arti e organi addominali. Girare l'embrione e tenerla ferma con un set di pinze. Snip per tutta la lunghezza dell'embrione, dal collo alla coda, fino a quando il cavo tutto è esposto. Afferrare l'estremità del cavo con attenzione e tirarlo su se stesso verso la coda da rimuovere. Il cavo tirerà libero con membrana e dei gangli spinali (DRG) allegato. Se DRG espianto o dissociati cultura neuroni sensoriali deve essere eseguita, snip DRG il cordone e trasferirli in un piatto fresco di caldo L15. Per i DRG cultura espianto, passare alla fase 10,2 Per dissociato cultura neuroni sensoriali, passare al punto 9 Per la cultura del motoneurone, il DRG verrà rimosso con la membrana al passo 7,5 Rimuovere la membrana dal midollo spinale afferrandolo all'estremità superiore del cavo e peeling verso il basso, simile a rimuovere un calzino lungo. Ripetere l'operazione per tutti gli embrioni e poi tagliare le corde in piccoli (2-3 mm) pezzi. <pclass = "jove_title"> 8. Motor Neuron (MN) Elaborazione 5,6,7 Versare i cavi tritato e L15 in una forma conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 minuti per far sedimentare i pezzi. Eliminare il sopranatante ed aggiungere 3 mL di tripsina alle corde pellet. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 20 min. Aggiungere 3 ml di FBS conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 min a ri-pellet. Eliminare il sopranatante e un cappotto lucido fuoco pipetta Pasteur con FBS. Aggiungere una pipetta Pasteur-pieno di L15 alla conica e poi triturare delicatamente fino a quando la soluzione è omogeneo senza grumi visibili. Evitare bolle. Preparare una soluzione al 9% di Optiprep in L15. Preparare un tubo con 3 ml di soluzione Optiprep per ogni due embrioni (se c'è un numero dispari di embrioni, arrotondare per eccesso). Goccia la soluzione omogeneizzato sulla soluzione Optiprep, divide equamente tra tutti i tubi. Spin le provette a 2000 RPM per 15 minuti. Raccogliere accuratamente la parte superiore da 2 ml ciascuna provetta e piscina in una conica da 50 ml. Riempire il conico con L15 e far girare a 1000 RPM per 5 minuti per sciacquare le cellule del Optiprep. Eliminare il sopranatante e risospendere le cellule in una piccola quantità di terreni in piastra (250-500 mL). Contare le cellule utilizzando esclusione blu trypan per identificare le cellule vive. Passare al punto 10,1 9. Sensoriale Neuron (SN) Elaborazione 7 Versare il DRG rimosso dal midollo spinale e L15 in un tubo conico e girare a 1000 RPM per 2-3 minuti per far sedimentare i pezzi. Eliminare il sopranatante ed aggiungere 3 mL di tripsina al DRG pellet. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min. Aggiungere 3 ml di FBS conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 min a ri-pellet. Eliminare il sopranatante e un cappotto lucido fuoco pipetta Pasteur con FBS. Aggiungere una pipetta Pasteur-pieno di L15 alla conica e poi triturare delicatamente fino a quando la soluzione è omogeneo senza grumi visibili. Evitare bolle. Spin l'omogeneizzato a 1000 rpm per 5 min. Eliminare il sopranatante e risospendere le cellule in una piccola quantità di terreni in piastra SN (250-500 mL). Contare le cellule utilizzando esclusione blu trypan per identificare le cellule vive. Continuare a passo 10,1 10. Placcatura e Cultura Per dissociato SN o MN cultura: Coprire i substrati con alcune gocce di media quindi aggiungere un volume adeguato di sospensione cellulare. Cellule dissociate dovrebbe essere placcato a bassa densità (25-50 cellule / mm 2). Consentire alle cellule di aderire per almeno un'ora prima di allagare i pozzetti con i media. Per i DRG cultura espianto: Coprire i substrati con alcune gocce di media quindi aggiungere DRG ai media. Disporre i DRG in modo che siano distribuiti uniformemente in tutto il substrato (circa 4 DRG si inserisce su un foglio 22×22 copertina mm). Lasciare che il DRG di aderire per almeno 4 ore prima di allagare i pozzetti con i media. Culture può essere mantenuta per un massimo di 4 giorni senza cambiare supporto. Per i più culture, la metà cambiamenti dei media dovrebbe essere fatto con mezzi di feed. Alimentazione dei supporti è la stessa composizione di terreni in piastra meno la L-glutammina. 11. Immunocitochimica 1,5,8 Fissaggio delle cellule: i media Aspirare e sostituirlo con caldo al 4% PFA (paraformaldeide) per 30 minuti. Quindi eseguire 3X 5 min 1x lavaggi PBS. Blocco / permeabilizzazione: Preparare blocco / perm soluzione (1,25% siero albumina bovina in PBS 1X, 0,05% Triton X-100 e il 2,0% di siero normale di capra). Aspirare il PBS e applicare blocco / perm soluzione ai campioni per 30 minuti. Quindi eseguire 1X 5 min 1x lavaggi PBS. Anticorpo primario: Preparare la soluzione primaria di anticorpi di lavoro (10% siero di capra normale, 1,25% di sieroalbumina bovina, 0,1% Na azide, 0,05% Triton X-100 e a 10 ml con PBS 1x). Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo primario (vedi tabella 2). Linea di piatti diversi con parafilm. Mettere una goccia 200μl di soluzione dell'anticorpo primario sul parafilm per ciascun substrato. Invertire la substrati, galleggiante loro lato della cella verso il basso la soluzione di anticorpo primario di lavoro durante la notte (se la stanza è dotata di aria condizionata o particolarmente secchi, un pezzo di carta saturi d'acqua può essere aggiunta in un angolo del piatto per evitare l'evaporazione della soluzione di lavoro) . Anticorpo secondario: Rimuovere i substrati dal primario (la soluzione di lavoro può essere raccolto, conservato a 4 ° C e riutilizzati) ed eseguire 2X 5 min 1x lavaggi PBS. Applicare 200 microlitri anticorpo secondario diluito 1:200 in PBS (anche rovesciato su un piatto rivestito parafilm) per 4 ore. Togliere dal secondario quindi eseguire 2X 5 min 1x lavaggi PBS. Substrati montaggio su vetrini con Prolungare oro contenente DAPI o un altro contatore adatto nucleare macchia. 12. Rappresentante dei risultati: La morfologia tipica della allineate e casuale elfibre ectrospun sono mostrati in Figura 1. Noi di solito ottenere la purezza MN di> neuroni del 90% 7,8 con questo protocollo e abbiamo mantenuto DRG culture per tutto il tempo una settimana, senza alcun significativa crescita dei fibroblasti. La figura 2 mostra l'aspetto tipico MN su vetro e fibre dopo 24 ore di cultura e immunocolorazione. DRG immunostained colto per tre giorni su vetro e fibre sono rappresentate nella figura 3. Figura 1. Allineamento fibra viene manipolata per scelta del collezionista. A.) Allineati fibre filate su un collettore ruota in movimento e B.) fibre casuale filato su un collettore piano fisso. Barre di scala = 20 micron. Figura 2. Motoneuroni rappresentante colorate per TuJ1 (verde) e DAPI (blu) dopo 24 ore di cultura sul PLL A. patinata) fibre e B.) di vetro. Barre di scala = 20 micron. Figura 3. DRG macchiato rappresentante per neurofilamenti (verde) dopo 3 giorni di coltura su PLL rivestito A.), vetro e B.) fibre. Barre di scala = 200 micron. Soluzione: MN media: DRG / SN media: 10 mg ml -1 albumina 12,5 microlitri – 10 mg ml -1 apo-transferrina 50 microlitri 40 microlitri 50 mg ml -1 β-estradiolo 2,7 microlitri 2,2 microlitri 0,1 mg ml -1 biotina 50 microlitri – 16 mg ml -1 catalasi 8 microlitri – 15 mg ml -1 D-galattosio 50 microlitri – 50 ml di idrocortisone mcg -1 3,7 microlitri 2,9 microlitri 0,63 mg ml -1 progesterone 0,5 microlitri – 16 mg ml -1 putrescina 50 microlitri – 50 mg ml -1 selenio 3,4 microlitri 4,1 microlitri 2,5 mg ml -1 superossido dismutasi 50 microlitri – * 500 ng mL -1 fattore di crescita nervosa – 1 ml * 100X PSN 0,5 ml 0,5 ml * B27 1 ml 1 ml * 2 mM L-glutammina 35 microlitri 35 microlitri * Neurobasal a 50 mL a 50 mL Tabella 1. Aggiungi protagonista (*) i componenti per i media al momento dell'uso. I restanti componenti possono essere preparati come una soluzione di riserva e conservato a -20 ° C fino al momento 6,7. Primaria (concentrazione) Neuroni: Glia: Fibroblasti: anti-β-tubulina (TuJ1) (1:1000) ✓ X X anti-neurofilamenti (1:1000) ✓ X X anti-S-100 (1:250) X ✓ ✓ NGFR anti-p75 (1:500) ✓ ✓ X Tabella 2. La selezione dei anticorpo primario dipende gli obiettivi del ricercatore. Quanto sopra sono anticorpi diversi e le concentrazioni che abbiamo usato con successo nel nostro laboratorio. S-100 è particolarmente utile per identificare le cellule di Schwann e / o verificare la presenza di contaminanti fibroblasti, ma nota che esso deve essere usato in combinazione con NGFR p75 di distinguere tra cellule gliali e fibroblasts4. Abbiamo anche notato che NGFR p75 macchie neuriti molto leggermente, mentre neurofilamenti o TuJ1 sono una ottima scelta, se l'obiettivo è quello di visualizzare neuriti individuali.