Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen
Summary
Een efficiënt systeem van de structuur en functie analyse van een gen in een<em> Ex vivo</em> Cultuur van milt B-lymfocyten wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van recombinante retrovirale de productie in een helper gratis, ecotrophic verpakking cellijn. Stabiele, erfelijke expressie van een gen van belang in primaire lymfocyten wordt bereikt leidt tot productie van antilichamen op het oppervlak B-cellen die een klasse switch recombinatie.
Abstract
De transgene expressie van genen in eukaryote cellen is een krachtig reverse genetische benadering, waarin een gen van belang wordt uitgedrukt onder de controle van een heterologe expressie systeem om de analyse van de resulterende fenotype te vergemakkelijken. Deze benadering kan worden gebruikt om een gen dat normaal gesproken niet wordt gevonden in het organisme te uiten, om een gemuteerde vorm van een genproduct te drukken, of om over-express een dominant-negatieve vorm van het gen product. Het is bijzonder nuttig in de studie van het hematopoëtische systeem, waar transcriptionele regulatie is een belangrijk controlemechanisme in de ontwikkeling en differentiatie van B-cellen een, beoordeeld in 2-4.
Muis genetica is een krachtig hulpmiddel voor de studie van de menselijke genen en ziekten. Een vergelijkende analyse van de muis en het menselijk genoom onthult de instandhouding van synteny in meer dan 90% van het genoom 5. Ook veel van de technologie die gebruikt wordt in muismodellen is van toepassing op de studie van de menselijke genen, bijvoorbeeld, gen storingen en allelische vervanging van 6 . Echter, de oprichting van een transgene muis vereist een groot deel van de middelen van zowel een financiële en technische aard. Verschillende projecten zijn begonnen met bibliotheken van knock-out muizen stammen (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) of mutagenese geïnduceerde stammen (RIKEN), die op grote schaal inspanningen en samenwerking vergen 7 samen te stellen. Daarom is het wenselijk om eerst onderzoek naar het fenotype van een gewenste gen in een cel cultuur model van de primaire cellen alvorens aan een muis model.
Retrovirale DNA integreert in het gastheer-DNA, bij voorkeur binnen of in de buurt transcriptie-eenheden of CpG eilanden, wat resulteert in een stabiele en erfelijke expressie van het verpakte gen van belang terwijl het vermijden van transcriptionele zwijgen 8 9. De genen worden dan overgeschreven onder de controle van een hoog rendement retrovirale promotor, wat resulteert in een hoge efficiëntie van transcriptie en eiwitproductie. Daarom kan retrovirale expressie worden gebruikt met cellen die zijn moeilijk te transfecteren, op voorwaarde dat de cellen zich in een actieve toestand tijdens de mitose. Omdat de structurele genen van het virus zijn vervat in de verpakking cellijn, de expressievectoren gebruikt om het gen van belang kloon bevatten geen structurele genen van het virus, die zowel de mogelijkheid van virale revertanten elimineert en verhoogt de veiligheid van het werken met virale supernatant als er geen besmettelijke virionen worden geproduceerd 10.
Hier presenteren wij een protocol voor recombinante retrovirale de productie en de latere infectie van de milt B-cellen. Na isolatie worden de gekweekte milt cellen gestimuleerd met Th afgeleid lymfokinen en anti-CD40, die een uitbarsting van B-cel proliferatie en differentiatie 11 induceert. Dit protocol is ideaal voor de studie van de gebeurtenissen laat in B-cel ontwikkeling en differentiatie, zoals B-cellen worden geïsoleerd uit de milt volgende eerste hematopoëtische gebeurtenissen, maar voorafgaand aan de antigene stimulatie om plasmacytic differentiatie te induceren.
Protocol
Discussion
Retrovirale transductie van milt B-cellen zoals hier beschreven en zoals afgebeeld in figuur 1 is een genetische benadering die nuttig is in de studie van de B-lymfocyten, omdat veel van de ontwikkeling gebeurtenissen in lymphopoesis worden bestuurd door transcriptionele regulatie 1, 2. In de latere stadia van de B-cel rijping, triggering via CD40L is essentieel voor de inductie van B-cel groei, toegang tot de celcyclus, en proliferatie 11, 20. Zoals weergegeven in figuur 2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK wordt ondersteund door de Columbia University Graduate programma. UB is Fellow van de leukemie en lymfoom Society of America, de ontvanger van New Investigator Award van de Leukemie Research Foundation en wordt ondersteund door de Columbia University New Faculty start-up fondsen.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
Referências
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. . Introduction to Genetic Analysis. , (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
