PCR Thermocycling السريع باستخدام الحراري الحرارية الميكروسكيل
Summary
نحن تصف طريقة جديدة لإجراء النسخ المتماثل الحمض النووي عن طريق تفاعل البلمرة سلسلة (PCR). هو تسخير الحمل الحراري للمكوك الكواشف مستمر بين تغيير طبيعة ، الصلب ، وشروط التمديد من خلال الحفاظ على معارضة السطوح من المفاعل في درجة حرارة ثابتة. هذا التصميم البسيط لجعل الوعود بطبيعتها السريع PCR أكثر سهولة.
Abstract
العديد من المقايسات البيولوجيا الجزيئية تعتمد في بعض الطريق على تفاعل البلمرة سلسلة (PCR) لتضخيم الحمض النووي المستهدف an تمييع البداية عينة لمستوى تركيز اكتشافها. إلا أن تصميم الأجهزة التقليدية thermocycling PCR ، ومقرها في الغالب على كتل ضخمة تسخين حرارة المعدن الذي ينظمه سخانات الحرارية ، يحد بشدة من تحقيق سرعة رد الفعل 1. مطلوب أيضا الطاقة الكهربائية الكبيرة للحرارة بشكل متكرر وتبريد خليط كاشف ، مما يحد من القدرة على نشر هذه الصكوك في شكل المحمولة.
وقد برزت الحراري الحراري كنهج بديل thermocycling الواعدة التي لديها القدرة على التغلب على هذه القيود 2-9. التدفقات هي حدوث الحمل الحراري اليومية في مجموعة متنوعة من الإعدادات التي تتراوح بين الغلاف الجوي للأرض ، والمحيطات ، والداخلية ، والمصابيح الملونة والمزخرفة الحمم. وبدأت حركة السوائل في بنفس الطريقة في كل حالة : عدم استقرار الطفو مدفوعة تنشأ عندما يتعرض يقتصر حجم السائل إلى التدرج في درجة الحرارة المكانية. هذه الظواهر نفسها تقدم وسيلة جذابة لأداء thermocycling PCR. من خلال تطبيق التدرج في درجة الحرارة ثابتة عبر هندسة المفاعل صمم بشكل مناسب ، يمكن إنشاء تدفق الدورة الدموية المستمرة التي ستنقل PCR الكواشف مرارا عبر المناطق حرارة المرتبطة تغيير طبيعة ، الصلب ، ومراحل تمديد التفاعل (الشكل 1). ولذلك يمكن أن يفجرها Thermocycling بطريقة شبه متساوي من خلال عقد ببساطة سطحين معارضة في درجات حرارة ثابتة ، والقضاء تماما على الحاجة لتسخين وتبريد مرارا الصك.
واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه تصميم thermocyclers الحمل الحراري هو الحاجة إلى التحكم بدقة في سرعة التوزيع المكاني ودرجة الحرارة داخل المفاعل لضمان أن تكون الكواشف احتلال المناطق بالتتابع درجة الحرارة الصحيحة لفترة كافية من الوقت 10،11. نحن هنا وصف نتائج الجهود التي نبذلها لتحقيق كامل 3 – D السرعة ودرجة الحرارة في التوزيعات الميكروسكيل thermocyclers الحملية 12. بشكل غير متوقع ، اكتشفنا مجموعة فرعية من مسارات تدفق المعقدة التي تبدو مواتية للغاية لPCR نتيجة لمزيج من التآزر (1) التبادل المستمر بين مسارات تدفق الذي يوفر فرصة لتعزيز الكواشف العينة إلى مجموعة كاملة من التشكيلات درجة الحرارة المثلى ، و ( 2) قضى وقتا في زيادة درجة حرارة المنطقة على تمديد معدل الحد خطوة من PCR. السريع للغاية مرات تضخيم الحمض النووي (تحت 10 دقيقة) قابلة للتحقيق في مفاعلات مصممة لتوليد هذه التدفقات.
Protocol
Discussion
لا يمكن للتفاعل بين التدفق والتفاعل الكيميائي تتغير بشكل كبير تحت تأثير التأفق الفوضى. لكن هذه الدول تدفق المعقدة تشكل تحديا للدراسة ، ولا سيما في هندستها واقعية حيث الآثار 3D تصبح مهمة. رايليغ – بينارد الحراري في ح / د> 1 ليس فقط يوفر منصة ملائمة لاستكشاف هذه الظواهر ، وتطبيقها لتنفيذ PCR كما يمكن اقتران بين التفاعلات الكيميائية وتدفق للبحث. هذه القدرة الفريدة تجعل من الممكن لتحديد الدول التدفق الأمثل حيث الفوضى آثار الفعل (counterintuitively) لتسريع وتيرة تكرار الحمض النووي.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بامتنان T. Ragucci ، واتكينز B. ، S. ونغ ، وباء في Wallek Lynntech ، وشركة للحصول على المساعدة الفنية ومناقشات مفيدة كثيرة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (NSF) في إطار منحة CBET – 0933688.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| KOD DNA Polymerase kit | Novagen | 71085-3 | ||
| TaqMan β-actin Control Reagents kit | Applied Biosystems | 401846 | ||
| Aluminum tape | Axygen, Inc. | PCR-AS-200 | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | ||
| Rain-X Anti-Fog | SOPUS Products | |||
| Long Gel-loading Pipette Tips | Fisher Scientific | 05-408-151 | ||
| FEP Teflon tape | McMaster-Carr | 7562A17 | ||
| Agarose gel | Bio-Rad | 161-3107 | ||
| TAE running buffer | Bio-Rad | 141-0743 | ||
| SYBR Green I | Invitrogen/Molecular Probes | S7563 | ||
| 6x Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | ||
| 100 bp DNA ladder sizing marker | Bio-Rad | 170-8202 |
Referências
- Spitzack, K. D., Ugaz, V. M., Minteer, S. D. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. Methods in Molecular Biology. , (2005).
- Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. PCR in a Rayleigh-Bénard convection cell. Science. 298, 793-793 (2002).
- Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. Exponential DNA replication by laminar convection. Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).
- Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling. Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).
- Wheeler, E. K. Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler. Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).
- Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems. Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).
- Ugaz, V. M., Krishnan, M. Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling. Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).
- Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system. Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).
- Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model. Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).
- Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. Coupled flow and reaction during natural convection PCR. Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).
- Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring. , (2010).
