Transfektion och Mutagenes av mål gener i Mosquito celler genom Låst nukleinsyra-modifierade oligonukleotider
Summary
Oligonukleotider kan användas för att platsen specifikt ersätta en enda nukleotid i transfekterade mål gener i både<em> Anopheles gambiae</em> Och<em> Anopheles stephensi</em> Celler.
Abstract
Plasmodium parasiter, vilka smittämnen av malaria, överförs genom bett från infekterade Anopheles myggor resulterade i över 250 miljoner nya fall varje år. Trots decennier av forskning finns det fortfarande inget vaccin mot malaria, understryker behovet av strategier roman kontroll. En innovativ metod är användningen av genetiskt modifierade myggor för att effektivt kontrollera överföringen malariaparasiten. Avsiktlig förändringar av cellens signalvägar i mygga, genom riktad mutagenes, har funnit att reglera parasit utveckling 1. Från dessa studier kan vi börja att identifiera potentiella gen mål för omvandling. Riktad mutagenes har traditionellt förlitat sig på homolog rekombination mellan en målgenen och en stor DNA-molekyl. Men den konstruktion och användning av sådana komplexa DNA-molekyler för generering av stabilt omvandlas cellinjer kostsamt, tidskrävande och ofta ineffektivt. Därför ger en strategi med låst nukleinsyra modifierade oligonukleotider (LNA-ons) ett användbart alternativ för att införa artificiella enda nukleotid substitutioner i episomal och kromosomala mål DNA-gen (över 2). LNA-ON-medierad riktad mutagenes har använts för att introducera punktmutationer i gener av intresse i odlade celler av både jäst och möss 3,4. Vi visar här att LNA-tillägg kan användas för att införa en enda nukleotid förändring i ett transfekterade episomal mål som resulterar i en övergång från blå fluorescerande protein (BFP) uttryck för grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck i både Anopheles gambiae och Anopheles stephensi celler . Denna omvandling visar för första gången att en effektiv mutagenes av mål gener i mygga celler kan vara medierad av LNA-ons och föreslår att denna teknik kan tillämpas på mutagenes av kromosomala mål in vitro och in vivo.
Protocol
Discussion
Här presenterar vi ett in vitro-metod och belägg för riktade konvertering av en enda nukleotid i en episomal gen mål efter transfektion av LNA-ons till A. stephensi och A. gambiae celler. LNA-ON-medierad genkonversion kräver induktion av en platsspecifik DNA-reparation svar; våra data tyder på att mygg celler kan stödja denna mekanism för platsspecifika mutagenes. Medan den metod som presenteras här bygger på omvandling av en episomal mål, våra data tyder på att LNA-ON-medierad k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Abbie Spinner vid California National Primate Research Center för hennes hjälp med flödescytometri. Denna studie fick stöd av medel från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIAID) National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 och AI078183.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
Referências
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
