酸修饰的寡核苷酸锁定核酸转染和蚊虫细胞的靶基因突变
Summary
寡核苷酸，可用于网站，专门替代的转靶基因的单核苷酸<em>按蚊</em><em>按蚊</em>细胞。
Abstract
疟原虫的寄生虫病，疟疾的病原体，导致超过250万，每年新感染者的感染按蚊蚊子叮咬传播。尽管有几十年的研究，还没有对疟疾疫苗，突出的新型控制策略的需要。一个创新的方法是使用基因改造的蚊子，有效控制疟疾寄生虫的传播。故意在蚊子的细胞信号通路的改变，通过有针对性的突变，已发现规范寄生虫的发展1。从这些研究中，我们可以开始转型，以确定潜在的靶基因。有针对性的突变历来依靠的一个靶基因和一个大的DNA分子之间的同源重组。然而，建设和使用等复杂的DNA分子稳定转化的细胞株的产生，是昂贵，费时，往往效率低下。因此，使用锁核酸修饰的寡核苷酸（LNA的组件）的战略提供了一个有用的替代引入episomal和染色体DNA基因的目标（2审查）人工单核苷酸替换。已使用的LNA – ON -介导的有针对性的突变引入点突变基因在培养细胞的酵母和小鼠3,4的兴趣。我们在这里展示，可用于低噪声放大器组件引入单一核苷酸开关按蚊和斯氏按蚊细胞在蓝色荧光蛋白（BFP）的表达绿色荧光蛋白（GFP）的表达变化，结果转episomal目标。这种转换表明，蚊子细胞中的靶基因的有效诱变可以介导的低噪声放大器组件和建议，这种技术可能适用，在体外和体内染色体目标诱变首次。
Protocol
Discussion
在这里，我们目前在体外培养的方法和一个episomal基因目标有针对性地转换为一个单核苷酸的证据，A中的LNA组件的转stephensi和A 。 冈比亚细胞。 LNA – ON -介导的基因转化需要一个站点特定的DNA修复反应诱导;，我们的数据表明，蚊子细胞可以支持这个站点特定的突变机制。虽然这里介绍的方法是转换的episomal目标的基础上，我们的数据表明，低噪声放大器（LNA）的ON…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢她用流式细胞仪的协助下在加利福尼亚州国家灵长类动物研究中心的Abbie微调。这项研究是由国家过敏和传染病研究所（NIAID）美国国立卫生研究院（NIH）AI073745，AI080799，和AI078183提供资金支持。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
Referências
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