Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

1. Voorbereiding van de Vis voor Gekoppelde Recordings Voorafgaand aan het begin van de procedure, voor te bereiden vijf belangrijke oplossingen, waaronder: Bad Solution, bad Oplossing met tricaïne (MS222), bad Oplossing met Formamide, Neuron Interne Solution en Muscle interne oplossing. Vervolgens verzamel een enkele larvale zebravis in de leeftijd van 72 tot 96 uur en de plaats in Bath Oplossing met tricaïne. Binnen een minuut van de blootstelling aan de narcose, zal de vis niet reageren op aanraking. Leg de vis op de top van een plastic schaaltje en, met behulp van een stereomicroscoop, onthoofden met een dubbele rand scheermesje. Breng de vis op een glazen opname kamer bedekt met Sylgard en gevuld met bad Solution. Bevestig aan de uiteinden door het invoegen van elektrolytisch aangescherpte wolfraam pinnen via de notochord. Maak een huidflap de buurt van de rostrale einde van de vis met een pin die een voldoende grip voor een paar fijne tang zal bieden. Verwijder de overliggende huid door vastgrijpen het in de buurt van de rostrale pin met een paar fijne pincet. Peel langzaam in de caudale richting om de huid te verwijderen. Behandel de vis met 3 ml van Bath Oplossing met Formamide gedurende 3-5 minuten om spiersamentrekkingen die kunnen interfereren met opnames te blokkeren. Was 5 keer met een normaal bad Solution. Verwijder een deel van de oppervlakkige laag van de spier in 5 tot 6 segmenten door voorzichtig sloop met de zijkant van een wolfraam pin. Breng de vis op een rechtop microscoop in een kooi van Faraday om elektrische ruis schild. De microscoop is uitgerust met een vast podium, lange werkafstand 40x objectief en zoom van 0,5 tot 4x. De microscoop is gemonteerd op een gemotoriseerde XY vertaling fase in om de voorbereiding tussen zenuw en spier onder een hoog vermogen te verplaatsen. Het gebruik van differentieel interferentie contrast optiek helpt bij het visualiseren van de neuronen. Onder de 0,5 x zoom, gebruik van een breed boring 15-micron pipet naar bovenliggende spier te verwijderen en het ruggenmerg bloot te leggen. Negatieve druk wordt aangebracht door middel van een 3 cc wegwerpspuit en spiercellen worden verwijderd een voor een. Deze procedure wordt herhaald voor 5 tot 6 dorsale segmenten van de skeletspieren. Dezelfde brede boring pipet wordt gebruikt om ook verwijderen van de bovenste twee lagen van ventrale spieren te richten op een snelle skeletspieren te verkrijgen. Hiermee is de voorbereiding voor gepaarde opnames en de microscoop zoom is verhoogd tot ongeveer 1,6 x. 2. Gepaarde Opnamen van Cap Motor-neuron en Target Muscle Cellen De gereinigde segmenten worden gescand om de CaP neuronen te vinden. Elke hemi-segment van het ruggenmerg bevat een groot, 10 micron diameter, CaP motor-neuron. Deze traanvormige soma is oppervlakkig gelegen onder de spinale dura de buurt van de caudale meest einde van de segmentale grens. Een CaP neuron is gekozen voor het opnemen en het ventrale doel spier in de aangrenzende caudale segment wordt gescand om de integriteit te controleren. Twee patch elektroden zijn geplaatst voor het opnemen, een voor de neuron en een tweede voor de spier. De bovenste elektrode heeft een ondiepe conus voor penetratie van de stoere spinale dura en de tip opening van ongeveer 2 micron. De onderste elektrode heeft een steilere conus voor lage weerstand voltage clamp-opname van de skeletspieren Plaats de elektrode neuron in een hoek van ongeveer 30 graden aan de spinale dura dringen, ongeveer een half-segment rostraal van de geselecteerde CaP neuron. Vooraf de elektrode met behulp van een axiale aandrijving manipulator, terwijl het aanbrengen van een zachte continue positieve druk van ongeveer 60 millimeter kwik. Omdat de elektrode breekt door de dura, kan de CaP neuron worden verdrongen door de perfusie van de elektrode, die een aanpassing van de focus. Wanneer de elektrode raakt de CaP neuron soma positieve druk wordt vrijgegeven en meestal resulteert in de onmiddellijke vorming van een gigaohm afdichting. Echter, in sommige gevallen een afdichting niet vorm aan, wordt het noodzakelijk om een ​​lichte negatieve druk toe te passen. Na de vorming van afdichting, is de elektrode potentieel aangepast aan-80mV en de toepassing van negatieve druk scheurt het celmembraan. De Cap neuron wordt gekenmerkt door een input weerstand van 140 tot 180 Mega-ohm en een actiepotentiaal dat schiet +40 millivolt. Dit wordt getoetst door het injecteren van stapsgewijs verhogen depolariserende stappen onder de huidige klem totdat de actiepotentiaal wordt opgewekt. Vervolgens wordt de microscoop verplaatst naar ventrale spieren met behulp van de XY-gemotoriseerd vertaler onder hoge vermogen. Een snelle spiercel is gekozen uit het doel veld. De spier elektrode is gevorderd in de richting van het doel spiercel onder positieve druk, die, wanneer losgelaten, vormt een gigaohm afdichting. De elektrode potentieel is aangepast tot -50 millivolt naar natrium kanalen inactiveren en onder zachte zuigen de celmembraan is gescheurd. Een daling van de weerstand tegen tot 100 tot 200 Mega-ohm en de plotselinge verschijning van de grote capacitieve transiënten signalen entry. Om te testenvoor gepaarde opname, de motor-neuron is gedepolariseerd door stapsgewijs grotere injecties van stroom af tot een actiepotentiaal wordt opgewekt. Op dit punt een eindplaat stroom moet worden opgewekt in de spier. Voortzetting van stimulatie van de motorneuron op een Hertz resulteert in een eindplaat stromingen zonder falen. Als de stimulus frequentie wordt verhoogd tot 100 Hertz de eindplaat stromingen fluctueren in amplitude en ondergaan functionele uitputting binnen de 10 seconden van de stimulatie. 3. Representatieve resultaten Typisch, het neuron opname is stabiel tot maximaal een uur, maar de spiercellen verslechteren zoals blijkt als een toename van de serie weerstand. Wanneer dit gebeurt het experiment is of beëindigd of een andere spier cel patch geklemd. Alle opnames moeten binnen een uur. Figuur 1. Opnames van het motorneuron actiepotentiaal (AP, boven) en de bijbehorende spier eindplaat huidige (EPC, onderaan). De actie potentieel voor een CaP neuron moet overschrijding +40 mV en de EPC moet stijgen binnen de 300 μsec en verval langs een exponentiële tijdsverloop met een tijd constant onder 1 msec. Naam Recept Bath Solution (in mm) 134 NaCl, KCl 2,9, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7,8 Bath Oplossing met tricaïne Bath Oplossing bevattende 0,02% tricaïne Bath Oplossing met Formamide Bath Oplossing bevattende 2M formamide Neuron interne oplossing (in mm) 115 K-gluconaat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2 Muscle interne oplossing (in mm) 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 Tabel 1. Solutions.