Мониторинг Иммунные клетки торговли Флуоресцентный Прион стержни часов после внутрибрюшинного инфекции
Summary
Здесь мы опишем новый тест для мониторинга поглощения прионов и торговли иммунными клетками сразу же после внутрибрюшинного прививки, очищая и флуоресцентно маркировки агрегированных стержней прионов из инфицированного материала мозг, то контроль за их поглощения и движение от места инъекции и характеризующие клетки посредническую этих событий.
Abstract
Наличие ненормальной форме хост в кодировке прионных белков (PrPC), которые устойчивы протеазы, патологических и инфекционных характеризует прионных заболеваний, таких как хроническая изнуряющая болезнь (УХО) в cervids и скрепи у овец. Прионы гипотеза утверждает, что это ненормальное конформера составляет большую часть или все инфекционных прионов. Роль иммунной системы в ранние события в периферийных патогенеза прионных было убедительно продемонстрировано УХО и скрепи 1-3. Трансгенные и фармакологические исследования на мышах показали важную роль системы комплемента в сохранении и репликация прионов в ранние сроки после инфекции 4-6. В пробирке и в естественных исследованиях также наблюдается прионных удержания дендритные клетки 7-10, хотя их роль в торговле остается неясно 11-16. Макрофаги подобным же образом были замешаны в начале патогенеза прионных, но эти исследования были сосредоточены на событиях, происходящих недель после заражения 3,11,17. Эти предыдущие исследования, также страдают от проблемы различия между эндогенными PrP C и инфекционные прионы. Здесь мы опишем полуколичественного, непредвзятый подход для оценки поглощения прионов и торговли от прививки сайт иммунными клетками работу там. Агрегированные стержней прионов были очищены от инфицированных гомогената мозга моющее средство солюбилизации неагрегированном белков и ультрацентрифугирования через сахарозы подушке. Полиакриламидном геле, Кумасси синим окрашиванием и западных промокательной подтвердил восстановления обогащенного прионных стержней в гранулированной фракции. Прионы стержни флуорохромом меченных затем вводили внутрибрюшинно мышам. Через два часа иммунных клеток из перитонеального лаважа жидкости, селезенки и средостения и брыжеечные лимфатические узлы были исследованы на прион удержания стержня и клеточных подмножеств, определенных многоцветной проточной цитометрии с использованием маркеров для моноцитов, нейтрофилов, дендритные клетки, макрофаги и В и Т-клеток. Этот анализ позволяет впервые прямой мониторинг иммунных клеток приобретения и торговли прионов в естественных условиях в течение нескольких часов после заражения. Этот анализ также четко различает инфекционных, агрегированные прионы из PrPC обычно выражается на клетки-хозяина, который может быть сложным и привести к интерпретации данных проблем в других системах анализа. Этот протокол может быть адаптирован для других маршрутов прививки (устный, внутривенно, intranervous и подкожно, например) и антигенов (сопряженных бусы, бактериальных, вирусных и паразитарных патогенов и белки, яйцо), а также.
Protocol
Discussion
Здесь показано, протокол для маркировки и отслеживания прионов в естественных условиях, что значительно облегчает мониторинг ранних событий в периферической инфекции прион. Этот протокол значительно повышает на прошлых попытках мониторинга поглощения прионов в пробирке <su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Стива McBryant и Джефф Хансен за помощь в ультрацентрифугирования и Патти Кайзер за помощью мыши обработки. Национального института неврологических заболеваний и инсульта в Национальном институте здоровья, грант 5R01NS056379-02 финансируемой этой работы.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | ||
| Blender | Oster | 6694-015 | Use any commercial blender | |
| Centrifuge | Sorvall | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes | |
| Ultracentrifuge | Beckman | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes | |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | ||
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11 836 170 001 | ||
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power | |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Scientific | 53050 | ||
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g | |
| centrifugal filter columns | Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff | |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River | 207 | Use any inbred mouse strain | |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | ||
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | ||
| fluorescent antibodies | BD pharmingen | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. | |
| flow cytometer | Dakocytomation | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
Referências
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
- Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
- Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
- Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
- Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
- Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer’s patches’ dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
- Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
- Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
- Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
- Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
- Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
- Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
- Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
- Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
- Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
- Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
- Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).
