ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal
Summary
כאן אנו מתארים assay הרומן לניטור ספיגת הפריון וסחר על ידי תאים חיסוניים מיד לאחר חיסון intraperitoneal ידי מטהרים fluorescently תיוג מוטות הפריון מצטבר חומר במוח נגועים אז ניטור ספיגת שלהם תנועה מאתר ההזרקה ואפיון התאים לתווך את האירועים הללו.
Abstract
נוכחות של צורה חריגה חלבון מארח בקידוד Prion (PrPC) כי הוא פרוטאז עמידים, פתולוגיים ו זיהומיות המאפיינת מחלות Prion כגון מחלות כרוניות בזבוז (CWD) של cervids ו scrapie בכבשים. ההשערה Prion טוען כי זה לא נורמלי conformer מהווה רוב או את כל הפריון זיהומיות. תפקידה של המערכת החיסונית באירועים מוקדם בפתוגנזה הפריון היקפי הודגמה באופן משכנע עבור CWD ו scrapie 1-3. טראנסגנטי ו תרופתי מחקרים בעכברים גילה תפקיד חשוב של המערכת משלים שמירה פריונים משכפלים מוקדם לאחר ההדבקה 4-6. במבחנה במחקרים vivo הבחינו גם שימור הפריון על ידי תאים דנדריטים 7-10, למרות תפקידם בסחר נשאר ברור 11-16. המקרופאגים יש דומה היה מעורב בפתוגנזה הפריון מוקדם, אך מחקרים אלה התמקדו אירועים המתרחשים שבועות לאחר ההדבקה 3,11,17. אלה מחקרים קודמים גם סובלים מבעיה של הבחנה בין אנדוגני PRP C ו פריונים זיהומיות. כאן אנו מתארים גישה semiquantitative, משוחדת להערכת ספיגת הפריון וסחר מהאתר חיסון על ידי תאים חיסוניים גייסו שם. מוטות הפריון המצטברים היו מטוהרים מן homogenate המוח נגוע solubilization ניקוי שאינם מצטברים חלבונים ultracentrifugation באמצעות כרית סוכרוז. ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide, coomassie מכתים כחול המערבי התאוששות אישרו סופג מוטות הפריון מועשר בשבריר pelleted. מוטות Prion היו intraperitoneally מוזרק אז fluorochrome שכותרתו לעכברים. שעתיים אחר כך תאים חיסוניים מנוזל שטיפה פריטוניאלית טחול, ובלוטות לימפה mediastinal ו mesenteric היו assayed עבור החזקת הפריון מוט תת תא מזוהה על ידי זרימת cytometry ססגוניות באמצעות סמנים עבור מונוציטים, נויטרופילים, התאים הדנדריטים, מקרופאגים ו-B ותאי T. Assay זה מאפשר ניטור הפעם הראשונה הישירה של תאים חיסוניים רכישה פריונים סחר in vivo בתוך שעות לאחר ההדבקה. Assay זה גם ברור מבדיל זיהומיות, פריונים מצטבר של PrPC לידי ביטוי בדרך כלל על תאים המארח, אשר יכול להיות קשה להוביל לבעיות נתונים לפרשנות במערכות assay אחרים. פרוטוקול זה ניתן להתאים מסלולים חיסון אחר (דרך הפה, דרך הווריד, intranervous ואת תת עורי, למשל) ואת אנטיגנים (חרוזים מצומדות, פתוגנים חיידקיים, נגיפיים טפילי וחלבונים, ביצה) וכן.
Protocol
Discussion
כאן אנו מדגימים פרוטוקול תיוג פריונים מעקב in vivo זה מאוד מקל על ניטור אירועים בתחילת זיהום הפריון היקפי. פרוטוקול זה משפר באופן משמעותי על ניסיונות העבר על ספיגת הפריון ניטור במבחנה 9 ו – in vivo על ידי 3,12 inoculum מראש תיוג הפריון מועשר באופן חד משמע…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סטיב McBryant וג'ף הנסן לעזרה עם ultracentrifugation ופאטי קייזר לעזרה בטיפול העכבר. המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ במכון הלאומי לבריאות בארה"ב, להעניק 5R01NS056379-02 מימנה את העבודה הזאת.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | ||
| Blender | Oster | 6694-015 | Use any commercial blender | |
| Centrifuge | Sorvall | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes | |
| Ultracentrifuge | Beckman | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes | |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | ||
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11 836 170 001 | ||
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power | |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Scientific | 53050 | ||
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g | |
| centrifugal filter columns | Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff | |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River | 207 | Use any inbred mouse strain | |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | ||
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | ||
| fluorescent antibodies | BD pharmingen | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. | |
| flow cytometer | Dakocytomation | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
Referências
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
- Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
- Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
- Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
- Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
- Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer’s patches’ dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
- Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
- Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
- Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
- Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
- Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
- Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
- Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
- Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
- Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
- Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
- Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).
