Keten içinde değişiklikler Kalıtsal Çevre İndüklenmiş

1. Indükleyici koşullar altında keten Büyüme. 5 "tencere toprakla doldurulur ve onaylanır. Pot başına üç tohum ekildi ve ¼ inç derin toprak, tohum üzerinde onaylanır. Tencere sonra uygun besin çözümler 100ml ile sulanan Olmayan inducing kontrolü (C) koşulları her hafta 1 / 10 th gücü Miracle-Gro kullanın. Yüksek besin durumu (NPK tedavi) tam gücü Mucize haftalık uygulanan yetiştirin. Düşük besin – bitkiler sadece kendi büyüme boyunca uygulanan musluk suyu vardı. (Durrant 1971, Cullis 1980). Bitkiler, yaz aylarında doğal ışık altında yetiştirilir. Kış aylarında 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsü ile sodyum ışıkları altında yetiştirilir. Haftalık aralıklarla toplanan yaprakları ve meristemlerde. Bitki materyali hızlı bir sıvı nitrojen içinde dondurulur. Sonuçlar Üç genotipleri (Şekil 1) koşullara bağlı olarak farklı nispi oranları büyür. Bu nedenle kontrol koşulları altında Pl hattı L, S (Şekil 1a) daha kuvvetli olan en iyi yetişir. Düşük besinleri altında (su), S L veya Pl (Şekil 1b) ya da daha iyi yetişir. Yüksek besin altında (NPK) L sadece S (Şekil 1c) biraz daha iyi yetişir Pl daha iyi yetişir. Her üç farklı tedaviler altında yetiştirilen satırlar arasında bir karşılaştırma Şekil 1 d gösterilir f. Pl, kontrol koşulları (Şekil 1d), altında iyi yetişir, yüksek besin (Şekil 1e) ve S altında L iyi benzer yüksek besin ve kontrol koşulları altında (Şekil 1f). Bu veriler, üç satır üç ortamlarda büyüme göre ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. Not L (indüklenen altında) NPK koşulları altında en iyi yetişir Pl kontrol koşulları altında iyi yetişir. S geliştirilmiş besin koşulları yararlanmak mümkün değildir, ancak çok düşük bir besin koşullar altında büyümek için daha iyi yapabiliyor, her üç koşulları, aynı yetişir. Bitkilerin farklılaşma ile ilgili büyüme parametreleri (ve her yaprak arasındaki mesafe bu boğum uzunluğu, ile ilişkili), bitki boyu, yaprak boyutu ve dallanma derecesi içerir. Pl kontrol koşulları altında bitki dalları ile uzun boylu ve yaprakları büyük ve koyu yeşil renktedir. Düşük besinleri altında bitki çok kısa, her yaprağı arasındaki mesafe çok kısa ve yaprakları, küçük ve hafif yeşil. Ucunda yaprak, kök aşağı düşürmek daha koyu yeşil. Yüksek besin altında bitki kontrol koşulları altında, ana kök ve yan sürgünler hem kontrol bitkilerin daha kısa olması dışında çok benzer görünüyor. Büyük genotroph için bitkiler yüksek besin altında en güçlü büyüme dışında Pl bu çok benzer. Yine düşük besinleri altındaki bitki çok kısa ve açık yeşil yaprakları vardır. Yaprakları, düşük besin altında hafif yeşil olmasına rağmen S genotroph üç ortamlarda benzer yetişir. Ancak, S genotroph Pl veya L hatları ya da daha düşük besin koşullarında çok daha güçlü. 2. RNA ve DNA ekstraksiyonu, keten meristemlerde ve yaprakları ayrı ayrı yapılır. RNA ekstraksiyonu ve Qiagen DNeasy Bitki DNA hazırlık kiti DNA ekstraksiyon için kullanılan Roche toplam RNA hazırlık kiti kullanıldı. RNA Ekstraksiyon 3 meristemlerde artı bazı çevreleyen yaprak Eppendorf tüp depolama cryovial taşınmış ve zemin olmak için hazır olana kadar sıvı azot içine yerleştirilir. Steril kum tüpüne eklenir ve doku ince kadar micropestle kullanılarak öğütülür. Roche toplam RNA hazırlık kiti 400 ul lizis / bağlayıcı tamponu eklenir ve doku daha fazla zemin kümeleri görünür olana kadar. Örnek için 15 saniye, 1 dakika 13.000 rpm'de kum ve herhangi bir enkaz toplamak için spun sonra lizis yardım ve vortekslenmiş. Süpernatant sütun spin eklenir ve yönetmen olarak RNA hazırlık seti talimatlarını geri kalanı takip edilmektedir. DNAz tedavi 10X DNAz tampon 1 / 10 RNA numune hacmi eklenir. DNAz, 30 adet ilave edilir ve reaksiyon 37 inkübe ° C de 30 dakika ve 70 ° C 5 dk. Ters Transkripsiyon Her yöne 37 inkübe tepki ° C 1 saat ve 95 ° C'de 5 dakika. Applied Biosystems RNA cDNA kiti olarak kullanılır CDNA sonra PCR veya qPCR için kullanılır. qPCR qPCR ABI Adım Bir sistemi kullanılarak yapıldı. Tüm testlerin her çalışma, üç nüsha olarak yapılmıştır. Aktin gen kopya sayısı kontrolü olarak kullanılmıştırmevcut en iyi temizlik gen. Uygun primer çifti 1μl her tüpe eklendi. CDNA, uygun konsantrasyonda ve 9μl seyreltilmiş her tüpe eklendi 10μl 2x Güç SYBR Green PCR Mastermix (ABI) ve her tüp eklendi Program amplifikasyon programı: 10 dakika 95 ° C 95 15sn 40 döngü ° C, 60 ° C'de 1 dakika Amplifikasyon özgüllüğü doğrulamak için termal denatürasyon adım 2 değeri (- CTactin CTunknown) göreceli ifade düzeyleri tespit edildi. DNA hazırlığı Tampon AP1 Qiagen DNeasy Bitki DNA hazırlık kiti bir mikrofuge'de tüp içinde steril kum ile 6 yaprakları eklenir. Kümeleri görülebilir kadar doku micropestle zemin. Kit talimatlarını olarak takip edilmektedir. Sonuçlar Kök boyunca çeşitli pozisyonlarda yapraklarından izole edilen DNA PCR bitkiler indükleyici koşullar altında (4) büyürken, LIS-1 görünüm oluşur göstermektedir. QPCR sonuçları LIS-1 (veya indüksiyon ile ilişkili diğer genomik değişiklikler) varlığını hemen yakınında LIS-1 (Şekil 2) gen ifadesi etkilediğini göstermektedir. Şekil 2'de gösterildiği gibi altı genler farklı dört yüksek PL ifade (LIS-1 olmadan) ve S daha yüksek ifadesi (LIS-1 var) olan iki sahip Pl ve S olarak ifade edilir. Panel 1 ve 2 LIS-1 ekleme noktasına yakın iki gen vardır. Bu gen ifadesi, farklı büyüme koşulları altında büyük genotroph (indüklenen değişiklikler oldu ama LIS-1 bulunmamış) ve ifade LIS-1 ve ifade değişiklikleri arasında herhangi bir nedensel ilişkiyi belirlemek için gerekli olacaktır. Şekil 1: Pl, L, S, üç değişik besin rejimler altında büyüdü . Paneller bir kontrolü, b – düşük besin ve c – NPK. d – Pl, e – f – L. Panelleri d – f, soldan sağa: düşük besinler, kontrolü ve NPK. D – Pl, e-L, F – S. Şekil 2 LIS-1 yerleştirme noktası etrafında. Gen ekspresyonu. Gene 1 (büyüme Inhibitor) LIs1 hemen 5 've LIS-1 gen 2 (Kip-siklin-bağımlı kinaz inhibitörü id 3 "diğer genlerin inşa aynı iskele (~ 500kb) boyunca keten genom dizisi. Lütfen daha büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 3 Stormont Cirrus düşük besin koşullar altında yetiştirilen bitkilerin yaprakları ayıklanır DNA'lar PCR. PCR ürünleri% 2'lik agaroz-TBE jel ayrıldı. Uninserted site Paneli gösterilir, eklenen sitenin iki ucu b ve c Panelleri gösterilmiştir Yaprak örnekleri 1 – 6 haftalık aralıklarla örnek 1 ekim sonrası erken izole edildi.