Milieuvriendelijk Induced erfelijke veranderingen in de Flax

1. Groei van het vlas onder inducerende omstandigheden. 5 "potten zijn gevuld met grond en verstevigd. Drie zaden per pot worden geplant ¼ inch diep en de bodem verstevigd over de zaden. De potten worden vervolgens besproeid met 100 ml van de juiste voedingsstoffen oplossingen De niet-inducerende control (C) voorwaarden gebruik maken van een 1 / 10 e kracht van Miracle-Gro elke week. De hoge voedingsstoffen aandoening (NPK behandeling) had volle kracht Miracle Grow toegepast per week. Lage voedingsstof – planten alleen had leidingwater toegepast tijdens hun groei. (Durrant 1971, Cullis 1980). De planten worden geteeld onder natuurlijk licht in de zomer. Tijdens de winter zijn ze geteeld onder natrium lampen met een 16 / 8 uur licht / donker-cyclus. Met wekelijkse intervallen bladeren en meristemen worden verzameld. Het plantmateriaal is snel ingevroren in vloeibare stikstof. Resultaten De drie genotypen groeien met verschillende relatieve tarieven afhankelijk van de omstandigheden (figuur 1). Daarom onder controle van de voorwaarden Pl lijn groeit het beste met L zijn krachtiger dan S (figuur 1a). Onder lage voedingsstoffen (water), S groeit beter dan zowel L of Pl (Figuur 1b). Onder hoge voedingsstoffen (NPK) L groeit beter dan Pl die alleen groeit iets beter dan S (figuur 1c). Een vergelijking tussen elk van de lijnen gekweekt onder de drie verschillende behandelingen is weergegeven in figuur 1 d – f. Pl groeit het beste onder controle omstandigheden (figuur 1d), L de beste onder hoge voedingsstof (Figuur 1e) en S eveneens onder zowel hoge concentraties nutriënten en controle omstandigheden (figuur 1f). Deze gegevens tonen aan dat de drie lijnen kunnen worden gedifferentieerd op basis van hun groei onder de drie omgevingen. Van de nota is dat de Pl best groeit onder de controle condities, terwijl L groeit het beste onder de NPK omstandigheden (waaronder het werd geïnduceerd). S groeit ongeveer hetzelfde in alle drie de voorwaarden, dat wil zeggen, het is niet in staat om te profiteren van de verbeterde voedingsstoffen voorwaarden, maar is beter in staat om te groeien onder zeer lage voedingsstoffen omstandigheden. De groei parameters die relevant zijn voor de differentiatie van de planten zijn de hoogte van de plant (en in verband met deze internodium de lengte is, dat de afstand tussen elk blad), het blad grootte en de mate van vertakking. Voor de Pl onder controle omstandigheden de plant is lang met takken en de bladeren zijn groot en donker groen. Onder lage voedingsstoffen van de plant is erg kort, de afstand tussen elk blad is ook erg kort en de bladeren zijn klein en licht groen. De bladeren aan het uiteinde donkerder groen dan die lager op de stengel. Onder hoge voedingsstoffen de plant lijkt veel op dat de omstandigheden onder controle, behalve dat zowel de belangrijkste stam en de zijscheuten korter zijn dan in de controle planten. Voor de grote genotroph de planten erg lijken op die van de Pl, behalve dat de meest krachtige groei van de onder hoge voedingsstoffen. Weer onder een laag voor de plant is erg kort en heeft lichtgroene bladeren. De S genotroph groeit eveneens in alle drie de omgevingen, hoewel de bladeren zijn lichter groen onder het lage voedingsstoffen. Echter, in de lage voedingsstoffen voorwaarden de S genotroph is veel krachtiger dan een van de Pl-of L-lijnen. 2. RNA en DNA extracties uit vlas meristemen en bladeren worden afzonderlijk gedaan. De Roche totale RNA prep-kit werd gebruikt voor de RNA-extracties en de Qiagen DNeasy Plant DNA-prep-kit werd gebruikt voor de DNA-extracties. RNA-extractie 3 meristemen plus een aantal omliggende bladeren zijn verplaatst van de opslag cryovial in eppendorfbuisje en geplaatst in vloeibare stikstof tot klaar om te worden gemalen. Steriel zand wordt toegevoegd aan buis en weefsel is de grond met behulp van een micropestle tot boete. 400 ul lysis / bindingsbuffer van Roche in totaal RNA prep kit is toegevoegd en weefsel is verder de grond totdat er geen klontjes zichtbaar zijn. Monster wordt vortex gedurende 15 seconden om vervolgens lysis hulp en gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 13.000 rpm om zand en vuil te verzamelen. Supernatant wordt toegevoegd aan kolom draaien en de rest van de RNA-prep-kit instructies worden gevolgd zoals aangegeven. DNAse behandeling 1 / 10 RNA monstervolume van 10X DNAse buffer wordt toegevoegd. 30 eenheden van DNAse wordt toegevoegd en de reactie wordt geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 min en 70 ° C gedurende 5 minuten. Reverse transcriptie Applied Biosystems RNA naar cDNA kit wordt gebruikt als per richtingen reactie geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur en 95 ° C gedurende 5 minuten. Het cDNA wordt vervolgens gebruikt in PCR of voor qPCR qPCR qPCR werd uitgevoerd met behulp van een ABI Stap een systeem. Alle testen werden uitgevoerd in drievoud op elke run. De actine-gen werd gebruikt als een kopie-aantal controlede beste beschikbare housekeeping gen. De juiste primer paar werd toegevoegd aan elke buis in 1μl. Het cDNA werd verdund tot de juiste concentratie en 9μl toegevoegd aan elke buis 10μl van de 2x Macht SYBR Green PCR mastermix (ABI) en werd toegevoegd aan elke buis Het programma versterking programma is: 10 minuten bij 95 ° C 40 cycli van 15 seconden bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C Thermische denaturatie stap naar versterking specificiteit te controleren De relatieve expressie niveaus werden bepaald door de waarde van 2 (CTunknown – CTactin). DNA-voorbereiding Buffer AP1 van Qiagen DNeasy Plant DNA-prep-kit is toegevoegd aan 6 blaadjes met steriele zand in een microfugebuis. Het weefsel is grond met micropestle totdat er geen klontjes zichtbaar zijn. De kit instructies worden gevolgd zoals aangegeven. Resultaten PCR-amplificatie van het DNA geïsoleerd van bladeren op verschillende posities langs de stengel toont aan dat de verschijning van LIS-1 gebeurt, terwijl de planten groeien onder inducerende omstandigheden (4). De qPCR resultaten tonen aan dat de aanwezigheid van LIS-1 (of een andere genomische veranderingen geassocieerd met de inductie) de expressie van genen beïnvloedt in de directe omgeving van de LIS-1 (Figuur 2). De zes genen weergegeven in figuur 2 zijn alle differentieel tot expressie in de Pl-en S met vier met een hogere expressie in PL (zonder LIS-1) en twee met hogere expressie in S (die wel LIS-1). Paneel 1 en 2 zijn de twee genen die het dichtst bij het invoegpunt van LIS-1. De expressie van deze genen is in de grote genotroph (dat heeft geleid tot wijzigingen, maar heeft geen LIS-1) en de expressie onder verschillende groeiomstandigheden nodig zal zijn om een ​​oorzakelijk verband tussen LIS-1 en de expressie veranderingen vast te stellen. Figuur 1. Pl, L en S geteeld onder drie verschillende voedingsstoffen regimes. Panelen een – controle, b – een lage voedingsstoffen en c – NPK. d – Pl, e – S, f – L. Panelen d – f van links naar rechts: laag voedingsstoffen, controle en NPK. D – Pl, e – L, F – S. Figuur 2. Genexpressie rond het punt van insertie van LIS-1. Gen 1 (Inhibitor van de groei) is onmiddellijk 5 'naar LIs1 en het gen 2 (Kip-gerelateerde cycline-afhankelijke kinase-inhibitor id 3 "van LIS-1. De andere genen zijn allemaal langs dezelfde steiger (~ 500kb) opgebouwd uit de volledige vlas genoomsequentie. alstublieft Klik hier om een grotere afbeelding te zien . Figuur 3. PCR amplificaties van DNA's uit individuele bladeren van planten van Stormont Cirrus gegroeid onder lage voedingsstoffen omstandigheden. De PCR-producten werden gescheiden op een 2% agarose-TBE gel. De uninserted site is weergegeven in een panel, zijn de twee uiteinden van de ingevoegde plaats die op Panels b en c. Bladmonsters 1-6 werden geïsoleerd met wekelijkse intervallen met het monster 1 de vroegste na het zaaien.