Combinaison de adhésif à base de bandes d'échantillonnage et de fluorescence In situ pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais
Summary
Ce protocole décrit un simple adhésif à base de bandes approche pour l'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivie d'une détection rapide des cellules de l'ensemble du<em> Salmonella</em> En utilisant la fluorescence<em> In situ</emL'hybridation> (FISH).
Abstract
Ce protocole décrit une méthode simple pour les adhésifs à base de bandes d'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivi par le bande hybridation fluorescente in situ (FISH) pour rapidement indépendante de la culture de détection de Salmonella spp. Cell-bandes chargées peuvent également être placées face cachée sur une gélose sélective pour l'enrichissement en phase solide avant la détection. Alternativement, les enrichissements de liquide de faible volume (miniculture surface du liquide) peut être effectuée sur la surface de la bande dans un bouillon non sélectif, suivis par les poissons et l'analyse par cytométrie en flux. Pour commencer, ruban adhésif stérile est mis en contact avec des produits frais, une légère pression est appliquée, et la cassette est retirée, extraire physiquement les microbes présents sur ces surfaces. Les bandes sont montées collant vers le haut sur des lames de microscope en verre et les cellules prélevées sont fixés avec du formol à 10% (30 min) et déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol à (50, 80 et 95%; 3 min de chaque concentration). Ensuite, la cellule chargée des bandes sont repérés avec le tampon contenant un cocktail de Salmonella ciblées sonde ADN et hybrides pour les 15 – 30 min à 55 ° C, suivi par un bref rinçage dans un tampon de lavage pour enlever la sonde non liée. Adhérents, FISH cellules marquées sont ensuite contre-colorées avec de l'ADN de teinture 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et les résultats sont considérés en utilisant la microscopie à fluorescence. Pour en phase solide enrichissement, la cellule chargée des bandes sont placées face cachée sur une surface de gélose sélective adaptés et mis en incubation pour permettre la croissance in situ des microcolonies Salmonella, suivis par les poissons et la microscopie comme décrit ci-dessus. Pour miniculture surface du liquide, la cellule chargée des bandes sont placées côté collant et une chambre de perfusion de silicone est appliqué de telle sorte que le ruban et la forme de la lame de microscope fond d'une chambre étanche dans laquelle un petit volume (≤ 500 pi) de trypticase soja Bouillon (BST) est introduit. Les ports d'entrée sont fermées et les chambres sont incubées à 35 – 37 ° C, permettant une croissance basée sur l'amplification de la bande-extrait de microbes. Après incubation, les ports d'entrée sont descellés, les cellules sont détachées et mélangées avec le dos vigoureuse-et-vient de pipetage, récolté par centrifugation et fixés dans 10% du formol tamponné neutre. Enfin, les échantillons sont hybridés et examiné par cytométrie en flux pour révéler la présence de Salmonella spp. Comme il est décrit ici, notre "bande-FISH» approche peut fournir d'échantillonnage simple et rapide et la détection de Salmonella sur des surfaces de tomates. Nous avons également utilisé cette approche pour l'échantillonnage d'autres types de produits frais, y compris les épinards et les piments jalapeño.
Protocol
Discussion
Des méthodes simples et rapides pour la détection des pathogènes sur des surfaces de produire peut aider à atténuer les maladies d'origine alimentaire en fournissant des données pertinentes et appropriées. Adhésif méthodes d'échantillonnage basés sur la cassette ont été utilisés dans l'environnement, clinique et de microbiologie alimentaire depuis les années 1950 et impliquent appuyant sur "Scotch" style de bande à des surfaces pour l'élimination des microorganismes, suivi par …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de ce travail a été fourni par une croissance Iowa Fonds du Prix Valeurs à BFBS.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL | 745 | http://www.scientificdevice.com/ | |
| Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | ||
| Clear office tape, generic | Various suppliers | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | ||
| Food surface | Local grocery | Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here | ||
| Trypticase Soy Broth | Difco, Sparks, MD | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco, Sparks, MD | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco, Sparks, MD | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Various suppliers | RNase- and DNase-free | ||
| Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | |||
| NaCl solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) | |
| Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) | |
| Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies, Coralville, IA | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | ||
| Variable speed microcentrifuge | Various suppliers | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | ||
| CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR | PC1R-2.0 | Non-sterile | |
| Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber | |
| Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various suppliers | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | ||
| Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct | |
| Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide | |
| Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain | |
| Fluorescence microscope | Various suppliers | Leitz Laborlux S used here | ||
| Digital camera | Various suppliers | Canon PowerShot A640 camera used here | ||
| Image acquisition software | Various suppliers | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | ||
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | ||
| Flow cytometer | Various suppliers | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | ||
| Flow cytometry analysis software | Various suppliers | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |
Referências
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).
- Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. Skin sampling for Candida with adhesive tape. Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system. Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).
- Edwards, R. W., Hartman, E. A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces. Lloydia. 15, 39-39 (1952).
- Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. Microbiological monitoring of the food processing environment. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).
- Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces. J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).
- Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).
- La Cono, V., Urz, C. Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips. J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).
- Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations. Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).
- Langvad, F. A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves. Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).
- Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).
