Une plaque de microtitrage à 96 puits à base Méthode de formation suivi et les tests de sensibilité antifongique des Candida albicans Les biofilms
Summary
Nous décrivons une méthode simple, rapide et robuste pour la formation de<em> Candida albicans</em> Biofilms en utilisant des plaques de microtitration 96 puits et son utilité dans les tests de sensibilité antifongique de cellules au sein des biofilms.
Abstract
Candida albicans reste la cause la plus fréquente des infections fongiques chez une population en expansion des patients compromise et la candidose est maintenant le troisième plus fréquente d'infection dans les hôpitaux américains. Différentes manifestations de la candidose sont associés à la formation de biofilm, à la fois sur tissus de l'hôte et / ou des dispositifs médicaux (cathéters par exemple). La formation du biofilm porte négatives implications cliniques, comme les cellules dans le biofilm sont protégées par des réponses immunitaires de l'hôte et de l'action des antifongiques. Nous avons développé un modèle simple, rapide et robuste in vitro pour la formation de C. biofilms albicans aide de 96 puits de microtitration-plaques, qui peut également être utilisé pour tester la sensibilité aux antifongiques biofilm. La lecture de ce dosage est colorimétrique, basée sur la réduction du XTT (un sel de tétrazolium) par les cellules métaboliquement active biofilm fongique. Une expérience typique dure environ 24 h pour la formation de biofilms, avec un supplément de 24 h pour les tests de sensibilité aux antifongiques. En raison de sa simplicité et l'utilisation de matériel de laboratoire couramment disponibles et des équipements, cette technique démocratise la recherche biofilm et représente une étape importante vers la normalisation des tests de sensibilité aux antifongiques des biofilms fongiques.
Protocol
Discussion
Nous décrivons ici un moyen simple, rapide, économique et hautement reproductibles 96 modèle bien microplaque pour la formation de biofilms à Candida couplée à une méthode colorimétrique qui mesure l'activité métabolique des cellules au sein du biofilm en utilisant XTT. Ce modèle bien 96 microplaque pour la formation de biofilms a été initialement développé pour C. albicans, mais peut être utilisé pour d'autres espèces de Candida. et facilement adaptable à d'autr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biofilm liés travailler dans le laboratoire est financé par des subventions et numérotées R21DE017294 R21AI080930 de l'Institut national de recherche dentaire et craniofaciale et l'Institut national des maladies allergiques et infectieuses (pour JLL-R.). Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'NIDCR, le NIAID ou du NIH.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sabouraud-dextrose agar | Becton Dickinson | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates | |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures | |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation | |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher | BP308 | To buffer RPMI 1640 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma | P4417 | Buffer for washes | |
| XTT sodium salt | Sigma | X4251 | See above for preparation instructions | |
| Ringer’s lactate | Hospira | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution | |
| Menadione | Sigma | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-12 | ||
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | ||
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | |||
| Incubator | Any | |||
| Microtiter plate reader | Any |
Referências
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
