Количественная Синапсы: Иммуноцитохимическая основе Пробирной количественно Synapse Количество
Summary
Этот протокол содержит подробные сведения по количественному синапса числа как в диссоциированных нейронов культуры и в мозгу разделы, используя иммуноцитохимия. Использование купе-специфические антитела, мы обозначаем пресинаптических терминалах, а также участки постсинаптических специализации. Мы определяем синапсов как точки колокализации между сигналы, генерируемые этими маркерами.
Abstract
Одним из наиболее важных целей в области неврологии, чтобы понять молекулярные сигналы, которые поручить ранних этапах формирование синапса. Как таковое оно стало необходимым разработать объективные подходы к количественной оценки изменений в синаптических соединений. Начиная от образца фиксации, этот протокол содержит подробные сведения по количественному синапса числа как в диссоциированных нейронов культуры и в мозгу разделы, используя иммуноцитохимия. Использование купе-специфические антитела, мы обозначаем пресинаптических терминалах, а также участки постсинаптических специализации. Мы определяем синапсов как точки колокализации между сигналы, генерируемые этими маркерами. Число этих colocalizations является количественно, используя подключение Puncta Analyzer (написаны Бари Уорк, предоставляются по запросу, c.eroglu @ cellbio.duke.edu) в рамках программной платформы анализа ImageJ. Синапс анализа, описанного в этом протоколе могут быть применены к любой нейронной подготовки ткани или культуры, для которых селективное пре-и постсинаптического маркеров. Этот анализ синапса является ценным инструментом, который может быть широко использован в изучении синаптических развития.
Protocol
Discussion
Синапс анализа, описанного выше, основана в контексте наших экспериментальных целей, в которых мы ориентируемся в основном на возбуждающие проекции РГК, либо в очищенной культуры или в мозге разделе. Мы предоставили ссылку таблица с перечнем антитела, которые хорошо работают для марки…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Анализатор Puncta Плагин для изображения J была написана Барри Уорк (текущий адрес: Physion Consulting) в лаборатории А. Бен Баррес (Стэнфордский университет).
Финансирования;
- Альфреда П. Слоуна
- Эстер А. и Иосиф Klingenstein фонд, Inc
- Широкий биомедицинских исследовательского фонда
- Лекарство от болезни Хантингтона с инициативой
Materials
| Antigen | Species | Monoclonal/Polyclonal | Vendor | Catalog Number | Dilution | Works in Culture | Works in Sections | |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 106004 | 1:750 | Y | N.D. |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 106001 | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs | VAM-PS003F | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems | 141004 | 1:1000 | Y | N.D. | |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 105002 | 1:750 | Y | N | |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 104211 | 1:500 | Y | Y | |
| Synaptophysin (C1.7.2) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 101011 | 1:500 | Y | Y | |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore | MAB5502 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB5905 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB2251 | 1:2500 | N | Y | |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) |
Mouse | Monoclonal | Affinity Bio Reagents | MA1-045 | 1:750 | Y | N |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed | 51-6900 | 1:500 | N | Y | |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 160011 | 1:500 | Y | N.D. | |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore | AB5875 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 147003 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 147 | 1:200 | Y | Y |
Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.
| Reagent | Company | Cat. No. |
| PBS | Invitrogen | 20012-027 |
| poly-d-lysine | Sigma | P6407 |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 |
| Normal Goat Serum | Gibco | 16210 |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher | BP152-5 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
| l-lysine | Sigma | L-1137 |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
| 24-well culture plate | Falcon | 35-3047 |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | — |
| Supply | Company | Cat. No. |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR Scientific | 48393241 |
| Glass slides | VWR Scientific | 48311-703 |
Referências
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 .
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
- Schmidt, J. T. Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism. Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).
- Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
- Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).
- Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis. Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).
