Synapses Quantifier: un dosage à base d'immunocytochimie Quantifier Nombre Synapse
Summary
Ce protocole de détails comment quantifier le numéro de synapses neuronales dans la culture à la fois dissociées et dans les sections du cerveau en utilisant l'immunocytochimie. En utilisant des anticorps spécifiques du compartiment, nous appelons les terminaux présynaptiques ainsi que des sites de spécialisation post-synaptiques. Nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux générés par ces marqueurs.
Abstract
L'un des objectifs les plus importants en neurosciences est de comprendre les signaux moléculaires qui instruisent premiers stades de la formation des synapses. Comme tel, il est devenu impératif de développer des approches pour objectif de quantifier les changements de la connectivité synaptique. A partir de la fixation de l'échantillon, ce protocole décrit comment quantifier le numéro de synapses neuronales dans la culture à la fois dissociées et dans les sections du cerveau en utilisant l'immunocytochimie. En utilisant des anticorps spécifiques du compartiment, nous appelons les terminaux présynaptiques ainsi que des sites de spécialisation post-synaptiques. Nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux générés par ces marqueurs. Le nombre de ces colocalizations est quantifiée à l'aide d'un bouchon dans puncta Analyzer (écrit par Bary Wark, disponible sur demande, c.eroglu @ cellbio.duke.edu) sous la plateforme logiciel ImageJ analyse. Le dosage de la synapse décrite dans ce protocole peut être appliqué à toute la préparation du tissu neuronal ou d'une culture pour laquelle vous avez sélective des marqueurs pré-et post-synaptiques. Ce test synapse est un outil précieux qui peut être largement utilisée dans l'étude du développement synaptique.
Protocol
Discussion
Le dosage de la synapse décrit ci-dessus est basé dans le contexte de nos objectifs expérimentaux, où nous nous concentrons essentiellement sur des projections excitatrices du CGR, soit dans la culture purifiée ou dans la section du cerveau. Nous avons fourni un anticorps de référence table listant qui fonctionnent bien pour l'étiquetage des synapses excitatrices (tableau 1).
Ce test synapse peut être adaptée afin de quantifier le numéro de la synapse de toute la population ne…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dans le laboratoire de Ben A. Barres (Stanford University).: Puncta Plug-in pour Image J a été écrit par Barry Wark (Conseil Physion adresse actuelle) Analyseur
Financement;
- Alfred P. Sloan Foundation
- L'A. Esther et Joseph Klingenstein Fund, Inc
- Large Biomedical Research Foundation
- Cure pour l'Initiative maladie de Huntington
Materials
| Antigen | Species | Monoclonal/Polyclonal | Vendor | Catalog Number | Dilution | Works in Culture | Works in Sections | |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 106004 | 1:750 | Y | N.D. |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 106001 | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs | VAM-PS003F | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems | 141004 | 1:1000 | Y | N.D. | |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 105002 | 1:750 | Y | N | |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 104211 | 1:500 | Y | Y | |
| Synaptophysin (C1.7.2) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 101011 | 1:500 | Y | Y | |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore | MAB5502 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB5905 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB2251 | 1:2500 | N | Y | |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) |
Mouse | Monoclonal | Affinity Bio Reagents | MA1-045 | 1:750 | Y | N |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed | 51-6900 | 1:500 | N | Y | |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 160011 | 1:500 | Y | N.D. | |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore | AB5875 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 147003 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 147 | 1:200 | Y | Y |
Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.
| Reagent | Company | Cat. No. |
| PBS | Invitrogen | 20012-027 |
| poly-d-lysine | Sigma | P6407 |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 |
| Normal Goat Serum | Gibco | 16210 |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher | BP152-5 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
| l-lysine | Sigma | L-1137 |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
| 24-well culture plate | Falcon | 35-3047 |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | — |
| Supply | Company | Cat. No. |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR Scientific | 48393241 |
| Glass slides | VWR Scientific | 48311-703 |
Referências
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 .
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
- Schmidt, J. T. Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism. Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).
- Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
- Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).
- Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis. Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).
