Changements dans la morphologie glande mammaire et le risque de cancer du sein chez les rats

1. Ablation de la glande mammaire et abdominale Préparation d'un mont entier Euthanasier l'animal selon les directives du IACUC. Pin de l'animal sur le dos de ses jambes avec des aiguilles, ou du ruban adhésif les jambes sur le bord de surface, et essuyer la peau mouillée avec de l'éthanol (EtOH). Soulever la peau un peu avec des pinces et de ciseaux pointus faire une incision médiane dans la peau de départ entre la paire n ° 5 mamelons et couper vers le cou. Faire une incision Y inversé de la ligne médiane vers les pattes postérieures. Si les glandes mammaires thoraciques doivent également être recueillis, font aussi une incision Y de la ligne médiane entre la paire n ° 2 mamelons vers les pattes avant. Disséquer la peau avec des ciseaux ouverts sur un côté de l'incision Y inversé pour exposer la glande abdominale # 4 mammaire; les glandes mammaires sont attachés à la peau. Pin de la peau avec des aiguilles sur le bord de surface, complètement exposer la glande. Le travail d'un côté et la glande à l'époque. Disséquer la glande mammaire gratuite à partir de la peau soit en utilisant des ciseaux pointus et / ou d'un scalpel, à partir de la zone proximale proche de l'embout et le travail vers l'extrémité distale de la glande vers la colonne vertébrale de l'animal. (Cela peut prendre plusieurs minutes, surtout dans un vieux rat.) Immédiatement répandre la glande détachée sur une lame de verre convenablement étiquetés (utilisation d'un marqueur approprié permanente et / ou 'un stylo diamant »), et la propagation de la glande attentivement correspondant à sa taille d'origine et la forme in situ. La lame de verre doit être plus grand que la glande. Après la diffusion de la glande sur la lame, laissez-le reposer sur la table pour un moment, alors que la glande bâtons sur la lame, mais ne laissez pas sécher. Mettez le glisser dans un bocal contenant fixateur de Carnoy (75% d'acide acétique glacial, 25% d'éthanol absolu = EtOH), laissez-vous fixé à température ambiante (TA) dans la hotte pour 2 jours ou plus. Les diapositives peuvent aussi être laissé dans le fixateur pour une plus longue période de temps. Laver les lames dans EtOH à 70% pendant 1 heure à température ambiante. Rincer à l'eau distillée pendant 30 min à température ambiante. Colorer dans une tache de carmin d'alun *) pour 2 jours ou plus (jusqu'à ce que vous voyez que les ganglions lymphatiques ont taché grâce, regardez à l'arrière de la lame). Laver en série croissante d'EtOH, 1 heure dans chaque: 70% -> 95% -> 100%. Après le dernier lavage dans EtOH absolu mettre les glandes dans le xylène. Laissez reposer dans la hotte en RT au moins pour 2 jours. Cette dernière étape est la compensation de la délipidation sens glande mammaire de la plaquette mammaires graisse, et augmentation subséquente de la transparence. La plus grasse de la glande est le plus long temps de compensation est nécessaire. Monter avec des lamelles en utilisant un média de montage, comme Permount. Laissez bien sécher les diapositives (plusieurs jours) avant d'observer sous un microscope stéréo. * Alun Carmine taches: Placer 1 g de carmin (Sigma C1022) et 2,5 g de sulfate de potassium en aluminium (Sigma A7167) dans 500 ml d'eau distillée et faire bouillir pendant 20 min. Ajuster le volume final à 500 ml avec de l'eau. Filtre et réfrigérer. Solution peut être utilisée pendant plusieurs mois. Jetez quand la couleur devient faible. 2. L'analyse de la morphologie mammaire Gland mont entier Mammaire toute la glande monte morphologie est analysée selon les critères suivants end-points et les résultats en corrélation avec le risque de cancer mammaire. Glande mammaire toute monture au PND 21 (pré-pubères âge): De croissance épithélial: Distance de la tétine à la fin de l'arbre épithéliales (en millimètres), mesurée à l'aide d'une règle Potentiel de transformation maligne: Nombre de TEBS (bourgeons extrémité terminale), comptés sous un microscope optique. TEBS sont les plus grandes structures bulbeuses situé à seulement à l'extrémité distale de l'arbre épithéliales mammaires Différenciation: AB1 (alvéolaire bourgeon) score (0-5). Bourgeons alvéolaires sont réparties à travers l'épithélium. AB2 score de (0-5) Monte Entières sont marqués d'un microscope optique. Les valeurs de score d'AB1 et AB2 sont ajoutés pour un score de différenciation finale. Glande mammaire toute monture collectées au PND 50 (post-pubères âge): De croissance épithélial: Distance à partir du noeud lymphatique à la fin de l'arbre épithéliales (en millimètres), mesurée à l'aide d'une règle. Distance de la pointe de l'arbre de l'épithélium à la fin du coussinet adipeux, mesurée à l'aide d'une règle. Potentiel de transformation maligne: Nombre de TEBS, comptés sous un microscope optique Différenciation: AB1 score de (0-5) AB2 score de (0-5) Score lobules (0-5) Monte Entières sont marqués d'un microscope optique. La différenciation sera évalue de deux manières. Tout d'abord, les valeurs score de AB1, AB2 et lobules sont ajoutés pour un score de différenciation finale. En outre, le ratio entre le score lobules et AB1 AB2 + score sera calculé. ABs différencier pour lobules, et plus le rapport entre les lobules et ABS, le plus différencié de la glande est. 3. La palpation et la mesure de tumeur mammaire chez le rat et la corrélation de la morphologie glande mammaire Pour commencer cette procédure, maintenez le rat en saisissant l'ensemble du corps avec la paume sur le dos, avec l'index derrière la tête et le pouce et le majeur sous l'aisselle opposée. Tournez le rat il est couché sur son postérieur, et palper pour détecter toute tumeurs mammaires, tumeurs palpables devrait se sentir comme un «forfaitaire». Suivant l'utilisation d'un pied à mesurer la largeur, la longueur et la hauteur de la tumeur. Calculez le volume de la tumeur en utilisant la formule ellipsoïde, Volume = 1/6πabc, où 'a' = largeur, la longueur 'b' =, et 'c' = hauteur. Enregistrer manuellement l'emplacement et la taille de la tumeur dans un carnet sur une base hebdomadaire. Ces données seront transférées vers un tableur tard. 4. Les résultats représentatifs Une dissection minutieuse du pad mammaires graisse et son traitement au wholemount permettra d'évaluer l'état de développement de la glande mammaire. Lorsque chaque étape est effectuée correctement, l'ensemble des arbres épithéliales mammaires est clairement visible dans le coussinet adipeux, ce qui permet de déterminer facilement le nombre de TEBS et le calcul de la densité des bourgeons alvéolaires et lobules. Faux pas dans les échantillons entiers préparation peut inclure l'échec de disséquer le pavé toute la graisse, la fixation insuffisante, et la compensation inadéquate. Évaluation de la morphologie de la glande mammaire va fournir des informations sur le nombre de présents des structures qui peuvent donner lieu à des tumeurs mammaires (TEBS), le degré de différenciation des structures épithéliales (bourgeons alvéolaires et lobules), et mesure de la croissance (élongation canalaire). Il est important de séparer TEBS aux extrémités terminales; ces derniers sont situés à l'extrémité distale de l'épithélium, à l'instar TEBS, mais ils sont plus petits que TEBS et ne donnent pas naissance à des tumeurs malignes. Extrémités terminales sont également vus dans l'arbre épithéliales. Figure 1:. Résultat représentatif du bien préparés monter la glande mammaire de toute Tous les composants de la glande ont été correctement disséqués et coloration carmin est optimale. Figure 2:. Résultat représentatif d'une monture mal préparés glande mammaire toute la glande a été correctement disséquées (la partie distale de la glande est manquante), n'a pas été correctement tendue et délipidation n'a pas complètement eu lieu.