1）准备瘫痪检测线虫生长介质板。 麻痹检测执行标准线虫的生长介质（NGM）常规的 C板线虫的繁殖和遗传学（Stiernagle 2006年）。 高压灭菌的NGM的溶液中含有氯化钠，蛋白胨琼脂和一个锥形瓶中，并添加适当的数额无菌氯化钙 2，尿嘧啶，胆固醇，硫酸镁1M 1M KPO 4 。分装10毫升的液体NGM到每60毫米× 15毫米培养皿。允许NGM，以巩固在室温下过夜。 如果测试化合物/提取，分装提取的影响到每个板块和使用吊具均匀地分布在板面的提取物。允许提取物在室温下过夜干燥。超过1毫升的量将需要更多的时间来干。 每盘现货250μL 大肠杆菌菌株 OP5O生长在LB培养基过夜光密度为0.4-0.6。使细菌在室温下干燥过夜。 相关变量板块的时代已经瘫痪检测的一个显着的影响，年纪较大的板块往往要干出。使用板浇瘫痪检测一周内。对于理想的效果，倒板前3-4天开始同步蠕虫人口以下（2）]。对于任何实验，只能使用同一批次浇板。 改变大小的草坪（即发现与传播）和/或细菌的类型，也将改变蠕虫的行为。可以使用替代性大肠杆菌麻痹检测作为食物来源（例如，用于喂养RNAi实验的HT115株），但可以改变瘫痪的动力学，因此需要适当的内部控制大肠杆菌 。 2）年龄同步蠕虫种群的制备应变CL4176（SMG – 1（cc546 TS）我; dvIs27 [MYO – 3 /Aβ的小基因+ ROL – 6（su1006）标记基因] X是最常用的化验Aβ引起的瘫痪，这种菌株和其他转基因模型可用。为一个象征性的费用从线虫遗传学中心 （http://www.cbs.umn.edu/CGC/）的学术研究。 为了最大限度地测试人群的年龄，最好是开始一个同步的亲代同步。一周前发起的试验人群的麻痹检测，使用铂金蠕虫选择器将其转移到了10厘米NGM的传播与OP50板为2小时蛋20-30妊娠的成年人躺在在16℃（CL4176宽松的温度）。取出妊娠的成年人，并让后代成长为7天，届时他们将“第二天”妊娠成人。 （第一天）第二天妊娠成人准备的年龄同步测试人群。对于每一个实验条件的对象是50-75年龄同步蠕虫生成一式三份板。使用铂金蠕虫选择器，转移到60毫米（10毫升体积）与OP50发现NGM板的第2天的妊娠成人10-12。允许蠕虫在16 ° C打下鸡蛋2个小时，然后摘掉成年人，让鸡蛋孵化，成长在16 ° C。在这一点上是最好的人谁也不会得分板代码，所以射手将是盲目的实验条件。 相关变量产卵时，胚胎发育阶段（〜26细胞阶段的最佳条件下的野生型蠕虫）是一个成人的年龄和营养的功能。如果用于编写测试人口的妊娠成年人老年人或饿死，稍后阶段鸡蛋将被解雇，减少了人口的年龄和重现性麻痹动力学同步。这是比单无菌（即，只有OP50细菌）用于文化（微生物污染物会严重影响这个实验），重现性是最高的，如果一式三份板有类似的蠕虫。 3）转基因诱导和瘫痪检测 （3天）至25日的上移板打下° C 48小时后同步鸡蛋;蠕虫应在第三幼虫阶段（L3）。板应安排无堆叠在25℃孵化器，以允许所有板块在同一时间达到25℃。 （4天）开始的蠕虫瘫痪（株CL4176）得分在18-20小时后开始的升档。此时，在人群中的所有蠕虫应该已经达到第四幼虫（L4）的阶段。继续在两个小时的的增量得分，直到每个板块上的所有蠕虫瘫痪。原因不明，瘫痪甚至整个车身长度：头部区域的最后一部分是蠕虫停止移动。因此，W最近发起瘫痪奥姆斯不能转化跨板，但可以将他们的头上，从而左右他们的前清除细菌和清除细菌留下了“光环”。这些蠕虫都会成为完全瘫痪，因此晕蠕虫被归类为瘫痪。有些蠕虫不会有光晕，但也不会显示自发的运动，这些都是刺激与蠕虫选择器进行测试。如果打了招呼的蠕虫无法接受一个完整的体波传播后打回原形，也取得了瘫痪。为了有效地得分，这是最简单的方法，使他们不会被无意rescored未来的得分期间，将瘫痪的蠕虫板unspotted部门。 （这也可以让错误分类的蠕虫展示运动，让得分校正）。 要生成一个瘫痪曲线，在每个时间点的蠕虫病毒在每个尚未瘫痪板的一小部分是转换为百分比，以及平均“unparalyzed”的比例是绘制免受升档启动时间。 （阴谋以这种方式的理由是，由此产生的曲线是正式类似的生存曲线，从而可以使用标准的非参数生存统计分析。） 相关变量必须发生之前，他们到达瘫痪中期L4阶段发起，MYO – 3启动子的发育调控，并大大减少了在后期L4或成虫表达的转基因myo-3/Aβ蠕虫升档。同样，这种基因的表达被阻塞，如果蠕虫成为饿死，因此至关重要的是，蠕虫是整个实验过程中精心喂养。我们从来没有看到一个瘫痪的蠕虫病毒，在任何条件下恢复，和升档12-16小时后，所有CL4176蠕虫会瘫痪，即使它们下移至16 ° C。 CL4176应变，足够的转基因表达的上调导致瘫痪可以发生在较低温度下（即，在20-25℃），虽然瘫痪的时间将被改变。瘫痪率取决于使用特定的转基因株（我们已经构建了更快和更慢的CL4176率myo-3/Aβ株），所以替代株得分窗口可能需要进行调整。 4）代表性的成果在图1所示为CL4176麻痹曲线的情节，都未经处理和暴露6.27毫米咖啡因（NGM板终浓度）。在一个高度统计学意义延迟约4小时，我们在此模型中，抑制Aβ的毒性指示瘫痪的治疗效果。在图2所示是一个独立的实验，化验cafestol，咖啡中发现的另一种化合物的影响。此图是典型的治疗，不影响Aβ的毒性。请注意，在两个实验中的一半左右未经处理的CL4176人口瘫痪24小时，并瘫痪28小时完成。这是典型的时限控制CL4176人口瘫痪。从这个时机的重大偏差的环境条件的改变或自发的转基因拷贝缺失的指示。 （CL4176包含一个集成的染色体myo-3/Aβ基因的多个副本的转基因阵列，尽管这种转基因阵列通常是相当稳定，任何传播的应变温度> 16 ° C将选择经历了罕见的蠕虫自发的转基因删除，导致变种，会减少Aβ的表达和较慢的瘫痪结果。） 图1。麻痹应变CL4176蠕虫未经处理或暴露到6.27毫米咖啡因（Sigma公司）的曲线 。表明次启动温度上移。误差线=扫描电镜 图2。麻痹CL4176蠕虫接触到0.48毫米cafestol（Sigma公司）的曲线 。误差线=扫描电镜