Vi beskriver а protokoll för isolering av rena, mycket kopplat råtta hjärta mitokondrier för funktionella eller strukturella studier av cellulära bioenergetik, biofysiska mätningar, proteomik eller mitokondrie-DNA och lipider analys.
Mitokondriernas funktion i produktionen av cellulära ATP i processen för oxidativ fosforylering är allmänt erkänt. Under de senaste decennierna har det skett betydande framsteg i vår förståelse av de funktioner mitokondrier än generera energi. Dessa inkluderar deras roll i apoptos, i egenskap av signalering organeller, däggdjur utveckling och åldrande samt deras bidrag till samordningen mellan cellens ämnesomsättning och celltillväxt. Vår förståelse av biologiska processer moduleras av mitokondrier är baserad på robusta metoder för isolering och hantering av intakt mitokondrier från vävnader i försöksdjur. Mitokondrier från råtta hjärta är en av de vanligaste preparat för tidigare och nuvarande studier av cellulär metabolism, inklusive studier på knock-out djur.
Här beskriver vi en detaljerad snabb metod för isolering av intakt mitokondrier med en hög grad av koppling. En sådan beredning av råtta hjärta mitokondrier är ett utmärkt objekt för funktionella och strukturella forskning om cellulära bioenergetik, transport av biomolekyler, proteomik studier och analys av mitokondrie-DNA, proteiner och lipider.
Detaljerade snabb protokoll för isolering av intakt mitokondrier med en hög grad av koppling beskrivs. Framställda preparatet kan användas för funktionell eller strukturell forskning om cellulära bioenergetik, proteomik eller analyser av mitokondrie-DNA och fett. Biofysiska studier av aktiv transport av joner och metabola intermediärer kan också göras. Det är möjligt att ytterligare bearbeta mitokondriella förberedelser för att isolera submitochondrial partiklar, yttre membran eller rena separata komponenter av oxidativ fosforylering. Den beskrivna metoden är en modifiering av standardprotokollet av isolering av Jacobus och Saks 1. Den förväntade avkastningen av det beredda mitokondrier är cirka 10-15 mg av mitokondrie protein per hjärtat och andningsorganen kontroll förhållande på malat / glutamat sådant preparat varierar mellan 8 och 12 med staten IV andning på cirka 0,12 mikromol O 2 xmin -1 xmg protein -1 vid 23 ° C på medellång består av 0,25 M sackaros, 10 mm KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mm kaliumfosfat (pH 8,0) med 150 mikroM ADP för initiering staten III andning (för exakt experimentella förhållanden och tillägg, se ref . 2).
Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt att flera tekniska detaljer innan start av isolering förfarande. Det är viktigt att använda rena polykarbonat eller polypropen centrifugrör, därför rör bör tvättas noggrant med en ren borste och varmt vatten, men den tvättmedel behandling bör hållas på ett minimum. Dessutom är det bättre att samla in all nödvändig glas och instrument i det kalla rummet en dag innan isolering.
Under isoleringen vid överföring buffertar från flaskor till bägare, bör а särskild uppmärksamhet ägnas att undvika droppar isvatten till lösningar. Vid hantering av vävnader det bör betonas att hjärtat utvinningen bör genomföras så snart som möjligt eftersom även kort fördröjning mellan halshuggning av djuret och kylning vävnaden skulle resultera i delvis frikopplad mitokondrier. Snabb nedkylning och grundlig tvättning av borttagna hjärtan är viktigt att få vanliga blandningen som är fri från hemoglobin och erytrocytporfobilinogen NADase.
Trypsin används för bindväv proteiner nedbrytning för att öka känsligheten av vävnaden till klippning kraft under homogenisering. Långvarig exponering av vävnad proteas bör undvikas, eftersom det resulterar i mitokondrierna av sämre kvalitet.
Efter snabb centrifugering väggarna i centrifugrör torkas med läskpapper att avlägsna alla avlagringar av fett material som samlats på väggarna.
För de sista resuspension är det bättre att använda en låg volym av de slutliga buffert för att minimera förlust av mitokondrie-funktioner under lagring (150 till 200 ìl av buffert per hjärtat). För studier av transport av tvåvärda katjoner ingen kelatbildare måste finnas i den slutliga beredningen alltså mitokondrierna ska tvättas flera gånger med EGTA-fria medium och används inom första timmarna efter isolering.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Prof. A. Vinogradov och Dr Vera Grivennikova för introduktion av författarna till området av mitokondrie biologi och många användbara insikter och råd i den här proceduren. Författarna är tacksamma till fru Amanda McKintock från Queens University media kontor för hjälp med videon förberedelser.