परिचय चूहे दिल से Mitochondria सेलुलर चयापचय के अतीत और वर्तमान के अध्ययन के लिए सबसे आम की तैयारी की है. वे बड़ी मात्रा में जल्दी और मज़बूती से कर सकते हैं जंगली प्रकार या दस्तक – बाहर पशुओं से प्राप्त है. सामान्य प्रक्रिया trypsin fractionation, और अंतर centrifugation द्वारा ऊतक पाचन के होते हैं. वहाँ कई स्थितियों है कि mitochondria के अलगाव के दौरान दिल (1 छवि) सहित विभिन्न ऊतकों से रखा हो रहे हैं. ऊतक अच्छी तरह से, कीमा बनाया हुआ हो सकता है क्योंकि यह सीधे प्राप्त mitochondria की उपज को प्रभावित करता है. हृदय के ऊतकों का सबसे अच्छा है छोटे घुमावदार कैंची के साथ कीमा और एक Latapie ऊतक चक्की उपयोग द्वारा पीछा किया जा सकता है है, या यदि एक ऊतक बनाने की मशीन उपलब्ध है, आउटलेट के आसपास 1.0 मिमी व्यास के छेद व्यास के साथ एक लहसुन प्रेस नहीं है. यह हर कदम पर समाधान के तापमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. इसलिए पूरी प्रक्रिया के लिए एक ठंडे कमरे और सभी उपकरणों में किया जाता है और समाधान करने के लिए तैयार रहना चाहिए और अग्रिम में ठंडा है. यदि तापमान की स्थिति नहीं रखा जाता है की तैयारी के स्थिर कई गुण खो जा सकता है. Mitochondrial संरचना बहुत तो निलंबन की overfreezing (centrifugation के दौरान उदाहरण के लिए) की अनुमति नहीं है, खासकर अगर सक्रिय परिवहन के अध्ययन महत्वपूर्ण हैं ठंड संवेदनशील है. एक महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रक्रिया के समय की लंबाई है, अलगाव के रूप में संभव के रूप में जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए है और प्राप्त की तैयारी करने के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा है. इसलिए, शल्य चिकित्सा उपकरण, समाधान और उपकरणों के लिए अग्रिम में तैयार रहना होगा. सामग्री और उपकरणों उपकरण सीधे ऑपरेटिंग कैंची, तेज बिंदु घुमावदार कैंची चिमटा पेट्री डिश लघु + कीप नायलॉन फिल्टर का टुकड़ा (prewashed) 6 50 मिलीलीटर beakers दो चुंबकीय stirrers और दो बर्फ स्नान एक बड़ा बर्फ स्नान 2 छोटे चुंबकीय सलाखों गोली के लिए Spatulas scraping अपकेंद्रित्र ट्यूबों Latapie ऊतक प्रेस (लहसुन प्रेस के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है) Teflon गिलास 20ml होमोजेनाइजर्स और 1-2ml अपशिष्ट बीकर अंतिम mitochondrial प्रोटीन निर्धारण के लिए निलंबन और नमूने के लिए Eppendorf ट्यूबों बर्फ स्नान समाधान (2 चूहों प्रति गणना): वॉशिंग बफर: 0.3 एम Sucrose, 10 मिमी HEPES (पीएच 7.2 =), 0.2 मिमी EDTA (1000 मिलीलीटर) अलगाव बफर: 0.3 एम Sucrose, 10 मिमी HEPES (= पीएच 7.4), 0.2 मिमी EDTA, 1 मिलीग्राम / एमएल (A6003 सिग्मा) BSA (100ml धुलाई बफर से तैयार). गोजातीय सीरम albumin कम खर्चीला फैटी एसिड मुक्त analogues द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. एक ही बफर या उसके isotonic विविधताओं बफर Resuspending के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. Trypsin समाधान (सिग्मा T8003) 1mm एचसीएल में 2.5mg/ml (0.5 मिलीलीटर) सोया से trypsin अवरोध करनेवाला (T9128 सिग्मा) 6.5 अलगाव बफर के mg/10 मिलीलीटर प्रोटोकॉल प्रक्रिया की सामान्य योजना छवि पर दिखाया है. 1. दिल और ठंडा होना चाहिए धुलाई बफर, निलय ऊतक excised, कीमा बनाया हुआ है और trypsin के साथ photolytic इलाज के दौरान homogenised में धोया. निलंबन कम गति पर centrifuged है और फिर से प्राप्त की सतह पर तैरनेवाला उच्च गति पर centrifuged है mitochondria इकट्ठा. योजना बनाई प्रयोगों के आधार पर resuspending बफर किसी अन्य isotonic समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. पशु अनुसार ब्रिटेन के साथ समाप्त किया गया "(वैज्ञानिक प्रक्रिया) पशु अधिनियम." गर्भाशय ग्रीवा के कत्ल द्वारा पीछा अव्यवस्था के द्वारा. यह जानवर के कत्ल के बाद तुरंत निकालने के दिल करने के लिए आवश्यक है, इसलिए है कि वहाँ जानवरों की समाप्ति और हृदय निष्कर्षण के बीच कोई देरी है. यदि mitochondria जिगर के समानांतर अलगाव की उम्मीद है चूहों प्रयोग करने के लिए पहले रात भर उपवास करना चाहिए. तीन बफर धोने के 40 मिलीलीटर युक्त beakers तैयार. उन्हें अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 3 से 5 मिनट के लिए बर्फ नमक स्नान में अच्छा है. उन्हें नहीं overfreeze और तुरंत का उपयोग बस के बाद बर्फ क्रिस्टल के बादलों को दिखाई शुरू करने के लिए सुनिश्चित करें. Decapitated चूहे की छाती खोलें और दिल निकालने. छोटे चीरों बनाओ और फिर तुरंत पहले बीकर में ठंडा समाधान के लिए दिल हस्तांतरण. हृदय के लिए रक्त को हटा दें और इसे दूसरे बीकर में डाल दबाओ. हर दिल के लिए दोहराएँ इस आपरेशन. फिल्टर पेपर पर दिलों सूखी. सभी वसा, पका हुआ, रक्त auricles और fasciae और पूल निलय ऊतक निकालें. लगभग 5 मिनट के लिए छोटे घुमावदार बर्फ पर पेट्री डिश पर कैंची के साथ जमा ऊतक कीमा तक कणों के आकार के बारे में 1-2 मिमी है. ऊतक प्रेस में कीमा बनाया हुआ ऊतक रखो और पासयह माध्यम से. पता है कि सामग्री का एक पर्याप्त राशि प्रेस में रहते हैं तो दीवारों और प्रेस के नीचे से सभी हृदय के ऊतकों को जमा कर सकते हैं. बीकर में 50 मिलीलीटर धुलाई बफर के साथ सामग्री और स्थानांतरण हलचल. फिर एक नायलॉन फिल्टर के माध्यम से निलंबन फिल्टर. फिल्टर 3 बार धुलाई बफर के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक और धो छानना त्यागें. स्थानांतरण धुलाई बफर के 20 मिलीलीटर में धोया ऊतक और यह चुंबकीय दोषी पर बर्फ स्नान में जगह. निरंतर क्रियाशीलता के तहत trypsin समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और टाइमर शुरू. दूसरे चुंबकीय उत्तेजक, बर्फ स्नान और एक दूसरे 50 मिलीलीटर बीकर तैयार. 4 वें मिनट में संक्षेप में कई और नीचे स्ट्रोक के साथ एक छोटा सा ढीला फिट गिलास Teflon homogeniser (10 15ml) का उपयोग करने के लिए निलंबन फैलाने के भाग के द्वारा निलंबन भाग homogenise. एकरूपता के दूसरे बीकर में निलंबन के बाद हस्तांतरण. 9 वें मिनट पर प्रक्रिया दोहराएँ, ताकि आप कुल में एकरूपता के निलंबन की दो बार प्रदर्शन . ऊष्मायन के 15 मिनट के बाद, बफर युक्त trypsin अवरोध करनेवाला को अलग करने के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिनट के लिए सेते हैं. निलंबन फिर से एक नायलॉन फिल्टर के माध्यम से और फ़िल्टर छानना बचाने. कण धुलाई बफर के 15-20 मिलीलीटर में 1 मिनट के लिए एक फिल्टर और homogenise पर छोड़ दिया अंश लीजिए. Homogenate छानना और 600g पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ जुडा है. ध्यान से एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला फिल्टर. गोली के संक्रमण से बचें और 8500g पर 15 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र. उच्च गति centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागने और बफर discarding के भुलक्कड़ सफेद बाहरी रिम परत 1 मिलीलीटर के साथ गोली 2-3 बार कुल्ला करें. रंग के साथ गोली तोड़ लेकिन एरिथ्रोसाइट्स के तल पर लाल जगह से बचने. यदि रक्त कोशिकाओं घरों में शौचालय मिला, एकरूपता पहले निलंबन से लाल बिट को हटा दें. गोली के साथ एक छोटा सा या कोमल pipetting द्वारा वैकल्पिक homogeniser Resuspend. अधिक Isolationbuffer के साथ निलंबन पतला और 8500g पर 15 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, बफर (पसंद का एक isotonic बफर) Resuspending में गोली resuspend और फिर अपकेंद्रित्र. परिणामस्वरूप भूरे रंग गोली धोया बरकरार mitochondria शामिल हैं. अपनी पसंद के isotonic बफर के एक बहुत छोटी मात्रा में गोली Resuspend. चित्रा 1 चूहे mitochondria दिल के अलगाव के कदम प्रक्रिया द्वारा कदम का प्रदर्शन योजना. शीर्ष भाग, 1-9 चरणों: ऊतकों के विघटन, trypsin उपचार और एकरूपता, नीचे के भाग, चरणों 10-15: अंतर centrifugation.