简介从大鼠心脏线粒体是细胞代谢的过去和目前的研究中最常见的准备工作之一。它们可以快速，可靠地获得了很大的数量从野生型基因敲除动物。一般程序包括胰蛋白酶，分馏和差速离心组织消化。 有几个条件，要保持在线粒体的分离，从各种组织，包括心脏（图1）。 该组织已被彻底剁碎，因为它直接影响产量获得线粒体。心脏组织是最好讳言小弯剪，可以接着使用Latapie组织磨床，或者，如果一个组织研磨机无法使用，与插座孔直径约1.0毫米直径的压蒜。 这是必要的温度维持在每一步的解决方案。因此整个过程必须在寒冷的房间和所有仪器和解决方案已提前准备和冷却。如果没有保存的温度条件，稳定的几个属性的准备可能会丢失。线粒体的结构是非常敏感的冻结，以便overfreezing暂停（例如在离心）是不允许的，尤其是如果研究是重要的主动运输。 一个重要的参数是该过程的时间长度;隔离应尽快进行，并获得准备立即使用。因此，手术器械，解决方案和设备要提前做好准备。 材料与仪器仪器直剪刀，尖弯剪刀镊子培养皿小漏斗+尼龙过滤片（预洗） 6烧杯50毫升磁力搅拌器和两个冰浴一个大冰浴 2个小型的磁力棒为颗粒铲刮离心管 Latapie组织记者（可取代压蒜） 铁氟龙玻璃均质20毫升和12毫升废物烧杯最终线粒体悬浮和测定蛋白质的样品的Eppendorf管冰浴解决方案（每2只计算）： 洗涤缓冲液：0.3米蔗糖，10毫米的HEPES（pH值= 7.2），0.2毫米EDTA（1000毫升） 分离缓冲液：蔗糖0.3米，10毫米的HEPES（pH = 7.4的），0.2毫米EDTA，1 mg / ml的BSA（Sigma公司A6003）（100毫升洗液编制）。牛血清白蛋白可以取代更便宜的脂肪酸类似物。相同的缓冲区或等渗的变化，可以用来作为Resuspending缓冲。 胰蛋白酶（Sigma公司T8003）解决方案：在1MM盐酸2.5mg/ml（0.5毫升） 从大豆的胰蛋白酶抑制剂（Sigma公司T9128）6.5 mg/10毫升隔离缓冲协议上图所示的程序的总体方案。 1。心应冷却和洗涤缓冲液，心室组织切除，切碎，并在光解治疗胰蛋白酶均质洗涤。悬挂在低速离心和更高的速度再次获得上清离心收集线粒体。根据计划实验resuspending缓冲区可取代任何其他的等渗溶液。 动物，终止与英国“动物（科学规程）法”的规定。“颈椎脱位由斩首。提取后，立即斩首的动物心脏，这是必要的，因此，没有任何动物终止和心脏提取之间的延迟。如果平行隔离肝线粒体预计应大鼠实验前禁食过夜。 准备三个含有40毫升的洗涤缓冲液的烧杯。在3至5分钟，然后再继续下一步的冰盐浴冷却他们。确保不overfreeze冰晶云后开始出现，并立即使用。 断头处死大鼠，打开胸腔，并提取心脏。小切口，然后立即转移的心冰冷的解决方案中的第一个烧杯。挤压心脏，以清除血液，并放入第二个烧杯。重复此操作，每个心。 干滤纸上的心。卸下所有的脂肪，血块，耳廓和筋膜和池心室组织。 百果汇集的组织，直到5分钟左右的小弯剪刀在培养皿上冰粒子的大小约1-2毫米。 组织按放入剁碎的组织和传递它通过。请注意，大量的材料可以在按下继续这样做从记者的墙壁和底部收集所有的心脏组织。 转移到烧杯中的物质与50毫升的洗涤缓冲液和搅拌。通过尼龙过滤器，然后过滤暂停。洗液洗净剁碎组织在过滤器上的3倍，并丢弃滤液。 转移到20毫升的洗涤缓冲液洗涤组织和放置在冰水浴磁力搅拌器。加入0.5毫升的胰蛋白酶不断搅拌下的解决方案，并启动计时器。准备另一磁力搅拌器，冰浴和第二个50毫升的烧杯。 在第 4分钟，简单地通过使用几个和向下招松散安装一个小玻璃均质聚四氟乙烯（10 – 15毫升），以驱散暂停部分均质暂停部分。均质后转移到第二个烧杯中暂停。 第 9分钟的重复过程，所以，你总执行暂停均质两次。孵育15分钟后，添加10毫升的隔离缓冲含有胰蛋白酶抑制剂和孵育1分钟。 暂停，再通过过滤器的尼龙过滤器，并保存滤液。收集的微粒分数左一个过滤器，均质，洗涤缓冲液15-20毫升1分钟。 合并滤液，离心15分钟在600克匀浆。 仔细筛选到一个新的离心管中产生的上清液。避免污染颗粒，离心15分钟8500克再次。 高速离心后，弃上清，用1毫升的缓冲区丢弃的蓬松的白色外缘层冲洗沉淀2-3次。分手的颗粒，但要避免用锅铲在底部红细胞的红点。如果血细胞得到洛斯，删除从均质前悬挂红色位。 用小均质或交替轻柔吹打重悬沉淀。更多Isolationbuffer悬浮液稀释，离心15分钟8500克再次。 弃上清，重悬在Resuspending缓冲区（选择的等渗缓冲）沉淀，离心一次。 由此产生的棕色颗粒包含洗完整的线粒体。在您所选择的等渗缓冲的体积非常小的重悬沉淀。 图1展示的隔离大鼠心脏线粒体的程序一步一步的计划。顶端部分，1-9阶段：组织受阻，胰蛋白酶处理和均质化;底部的一部分，阶段10-15：差速离心。