我々は細胞の生体エネルギー、生物物理学的測定、プロテオミクスやミトコンドリアDNAと脂質の分析の機能的または構造的研究のためのミトコンドリア純粋な、高度に結合したラット心臓の分離のためのаのプロトコルについて説明します。
酸化的リン酸化の過程で細胞内のATPの世代にミトコンドリアの機能が広く認識されている。過去数十年の間にエネルギーの世代よりもミトコンドリアの他の機能の理解に大きな進歩がありました。これらは、シグナル伝達細胞小器官、哺乳類の開発と高齢化だけでなく、細胞の代謝と細胞増殖の間の調整への貢献として機能する、アポトーシスにおける役割が含まれています。ミトコンドリアで変調された生物学的プロセスの理解が分離し、実験動物の組織から無傷のミトコンドリアの処理のための堅牢な方法に基づいています。ラットの心臓からミトコンドリアは、ノックアウト動物に関する研究を含む細胞代謝の過去と現在の研究のための最も一般的な準備の一つです。
ここでは、結合度の高い無傷ミトコンドリアの単離のための詳細な迅速な方法を説明します。ミトコンドリアラットの心臓のような製剤は、細胞の生体エネルギー、生体分子の輸送、プロテオミクス研究やミトコンドリアDNA、タンパク質や脂質の分析上の機能と構造の研究のための優れたオブジェクトです。
結合度の高い無傷ミトコンドリアの単離のための詳細な迅速なプロトコルが記述されています。て得られる製剤は、細胞生体エネルギー、プロテオミクス研究やミトコンドリアDNAと脂質含量の分析に機能的または構造的な研究に使用することができます。イオンと代謝中間体の能動輸送の生物物理学的研究も行うことができます。さらに亜ミトコンドリアの粒子、外膜を分離したり、酸化的リン酸化の別個の成分を浄化するために、ミトコンドリアの準備を処理することが可能です。記載された方法はジャコバス、サックス1による分離の標準的なプロトコルの変更です。準備ミトコンドリアの予想収量は、心臓あたりのミトコンドリアタンパク質の約10〜15ミリグラムであり、そのような準備のリンゴ酸/グルタミン酸に対する呼吸調節率は0.12前後モルO 2 xminは-1 XMGのタンパク質の状態IVの呼吸、8〜12の間に変化する23 -1 ° 0.25 Mショ糖を含む培地中でC、10mMの塩化カリウム、0.2mMのEDTA、正確な実験条件および付加のためのイニシエーションの状態IIIの呼吸(150μMADPで5 mMリン酸カリウム(pH8.0)に、refを参照してください2)。
特別な注意が分離手続の開始前にいくつかの技術的な詳細に与えられるべきである。それは、チューブが完全にクリーンなブラシや温水で洗浄する必要があるため、クリーンなポリカーボネートやポリプロピレン遠心チューブを使用することが重要ですが、界面活性剤処理は必要最小限度のものとすべきである。また、それは分離前日寒い部屋に必要なすべてのガラス器具や楽器を収集することをお勧めします。
隔離中にフラスコからビーカーにバッファを転送する際に、а特別な注意は、ソリューションに氷水の低下を防ぐために与えられるべきである。組織を取り扱う際には、心臓の抽出は、動物の斬首と組織を冷却する間にも短い時間遅延は部分的に非結合ミトコンドリアの結果になるので、できるだけ早く実施すべきであることを強調しておきたい。急速冷却と削除された心の徹底的な洗浄は、ヘモグロビンと赤血球NADaseからフリー、標準製剤を得ることが不可欠である。
トリプシンは、均質化中に、せん断力に組織の感受性を高めるために結合するタンパク質の分解に使用されます。それは低品質のミトコンドリアにつながるので、プロテアーゼの組織の長期ばく露は避けるべきである。
高速遠心後の遠心チューブの壁は、壁に蓄積された脂肪物質の付着物を除去するためにティッシュペーパーで拭き取ってください。
最終的な再懸濁するためには、貯蔵中のミトコンドリアの機能(心臓あたりのバッファ150〜200μlの)の損失を最小限に抑えるために、最終的なバッファの低容量を使用することをお勧めします。二価陽イオンの輸送の研究にはキレート剤は、EGTAを含まない培地で数回洗浄し、分離後の最初の時間内で使用されるべきであるため、ミトコンドリア、最終調製物中に存在してはならない。
The authors have nothing to disclose.
我々は、ミトコンドリアの生物学の分野への著者の紹介と、この手順では多くの有用な洞察とアドバイスを教授A.ビノグラードフ博士とヴェラGrivennikovaに感謝。著者らは、ビデオの準備のヘルプはクイーンズ大学メディアオフィスからミセスアマンダMcKintockに感謝しています。