콜드 preconditioning에서 Neuroprotection 연구를위한 전략

살균 및 무균 기술의 준비, 유지 보수 및 연장 기간에 대한 슬라이스 문화의 사용에 중요합니다. 또한, 오직 체외 18 일 후에 슬라이스 문화 우리의 사용에 대한 근거는 흥분성의 의미와 억제 시냅스 전달이 가장 성숙되고, glia (astrocytes와 microglia)는 정지 및과 일치되는 증거를 기반으로 자신의 생체내 매쉬에서 (그림 1 ). 1. Hippocampal 슬라이스 문화의 작성 및 유지 보수 culturing의 같은 날, 50 ML 기초 중간 이글, 25 ML 얼의 밸런스드 소금 솔루션 23 ML 호스 세럼, 0.5 ML Glutamax (200 MM 재고), 0.1 ML gentamicin (구성된 1.1 ML 성장 미디어에 살균 인서트 평형 10 MG / ML 주식), 0.4 ML Fungizone (250 μg / ML), 1.45 ML D – 글루코오스 (45 %, 42 MM 총). 36에서 인큐베이터에 여섯 잘 트레이 보관 ° C, 5 % 이산화탄소와 95 %의 습도. 최대한의 불임에 대한, culturing은 이상적으로 또한 자체 포함된 울트라 바이올렛 빛 공기 정화 팬들을 통해 정화 공기와 HEPA 필터 긍정적인 압력 문화 실에서 수행하고, 깨끗한 실험 복과 멸균 장갑을 착용하면서 실험실 외투 소매 끌었 . 모든 필요한 자료를 (즉, 맥일웨인 조직 헬기, 관련 테플론 삽입, 면도기 깔끔히 블레이드, 차가운 해부 (3-4 ° C) 판, 수술 도구, 해부 배양 접시)를 포함하는 BSL – 1 판상 퓸 후드에 슬라이스 문화를 준비 와일드 (M8) stereomicroscope를 사용합니다. 더욱 해부 영역 및 도구의 불임을 확립하기 위해 자외선을 해부 자료를 노출 동시에 동안 냉각 접시 (가까운 물을 욕조에서 실행) 적어도 30 분 3-4 ° C 온도에 도달하도록 허용합니다. 층류 후드는 정기적으로 자외선이 단파 자외선 라이트 측정 미터와 탁상 수준에서 충분한 전력을 보장하기 위해 테스트됩니다. 쥐 새끼를 (P8 – P9와 ~ 23g / 개. 출생시 10 학살 새끼에서) 이내에 100 % 에탄올에서 수영으로 후드 퓸과 처벌 뒤에 무균 작업대에 작은 동물 상자에 100 % 이산화탄소로 anesthetized 사용 이후의 모든 단계를 수행하는 퓸 후드. 100mm 페트리 접시 중 하나를 반으로 새끼 목을 벨과 강아지 당 신선한 요리를 사용하여, 하반기에 머리를 놓으십시오. 두뇌를 해부하다 그리고이 포함된 60mm 페트리 접시의 절반 아랫부분에 배치 10 ML 살균 추운 (3-4 ° C) 6.5에 D – 글루코오스와 보충 Gey의 밸런스드 소금 솔루션 MG / ML (즉, 45 7.5 ML Gey의 500 ML 병 당 %는 D – 글루코오스. 각 반구의 해마를 해부하다하고 맥일웨인 헬기에 테플론 디스크를 넣으십시오. 떨어진 절단 블레이드 준수에서 절단 두뇌 섹션을 방지하기 위해 홍채 주걱을 사용하여 뇌 조직에서 확산 미디어. 350-400 μm의에서 설정 섹션의 두께와 맥일웨인 헬기를 사용하여 긴 축에 섹션 hippocampi의 직각합니다. 여전히 쌩쌩하게 갓 테플론 삽입의 조각을 잘라 포함된 차가운 (3-4 ° C) 한 ML의 pipettor를 사용하여 6.5 MG / ML D – 글루코오스와 Gey의 밸런스드 소금 솔루션입니다.을 60mm 페트리 접시의 상반신에 씻어 손상 이가있는 이랑과 피라미드 세포 계층에 대한 stereomicroscope 아래의 슬라이스를 검사합니다. 부드럽게 인큐베이터에서 정상적인 배양 조건에서 삽입에 가장 큰 조각 (삽입 지당 3 12 조각 / 강아지) 장소 및 유지 보수 6 개월마다 청소하고 적외선 이산화탄소 분석기 한 소수점 자리로 정확한 온도계와 함께 3 개월마다 조정. 문화 요리 새로고침 성장 미디어 BSL – 2 후드 및 살균 기술을 사용하여 체외에있는 모든 3-4일. 체외 7 일 후에, 97 ML Neurobasal, 2 ML B27, 0.5 ML Glutamax (200 ㎜), 0.1 ML의 아스코르비 산 (0.5 M), 그리고 0.68 ML 구성된 1.1 ML 혈청 프리 미디어 (SFM)로 미디어를 교체 D – 포도당 (45 %, 42 MM 총). 2. 슬라이스 문화 사전 화면 활력 나누어지는 Sytox 그린 주식 (10 μL)와 -20 ° C.에 저장 혈청없는 성장 매체 농도 (즉, 100 ML 미디어 10 μL)를 작동 500 NM에 Sytox 주가 희석. 스토어 Sytox 미디어 4 ° C 최대 일주일을 위해 사용합니다. 플레이스 1.1 6 – 웰 문화 요리에 잘 당 Sytox의 ML과 36 따뜻한 ° C 충분한 기간 동안 5 % 이산화탄소 (즉, 문화 요리에 응축수의 부족에 의해 입증 등)에서. 한편, 안정화 전원 공급 장치를 통해 전원이 공급되는 자외선 램프가 (즉, FITC 필터와 형광등 광원) 최소한 20 분 온도 따뜻하게 균일 빛의 강도를 보장 수 있습니다. 플레이스 슬라이스 문화 (십팔일다음 10 분 Sytox 미디어의 체외에서 S)하고 다시 돌이킬 수 CA1 피라미드 계층 부상 화면으로 SFM 수 있습니다. 5 배 확대에 따라 검사를 거꾸로 현미경의 무균 표면에 문화를 볼 수 있습니다. CA1 지역에 적은 30 Sytox 긍정적인 세포와 문화를 받아들이십시오. 3. 콜드 – Preconditioning 6 – 잘 문화 요리 SFM 장소 1.1 ML. 냉각 매체 (예, 30 ° C)를 사용하기 전에 최소한 20 분 배양기 (5 % 이산화탄소와 95 %의 습도)에 평형 수 있습니다. 문화 요리에 응축수의 부재는 평균 위해 적절한 시간이 발생했습니다 나타냅니다. 냉각 매체 (1.1 ML / 음) BSL – 2 퓸 후드의 살균 기술을 사용하여 90 분 30 ° C와 부화에 보관 트레이에 슬라이스 문화 삽입을 전송합니다. 다시 BSL – 2 퓸 후드를 통해 살균 기술을 사용하여 24 시간 동안 정상적인 배양 조건에서 정상 SFM에 다시 슬라이스 문화를 놓습니다. 4. Excitotoxic 상해 20 분 대한 Sytox 미디어에 노출에 의해 문화 실험 사용 사전 심사를 슬라이스 시작합니다. 사전 심사 (배경 이미지)를 사용하는 것과 유사한 오리 엔테이션 유지 슬라이스 개별 슬라이스 이미지를 수집. 이것은 각각의 삽입에시 "두" "10"과에서 마커 펜으로 오른쪽으로 왼쪽으로 표시를 넣어 두 부호로 이루어집니다. 이 작전의 이미지 집합 각 문화에 대한 관심이 형태의 동일한 영역을 사용하여 용이하게합니다. 동시에, (규제 전원 공급 장치 이하) 자외선 램프의 소스​​를 설정하고, 온도 그래서 그들은 따뜻한 20 분 최소 CCD 카메라. 그런 다음, fluoroscein 표준과 CCD 카메라를 보정합니다. 자동 보정 CCD 카메라를 사용하지 않는 50주기 위해 빛에 노출에 의해 "지우기"CCD. 우리는 부상 부량 사용의 쿨 스냅 카메라 취소 MetaMorph 내에서 프로그램을 설립했습니다. 90 ML PBS (10 MM 인산 버퍼, 150 MM NaCl 7.3 산도)와 와동의 fluoroscein 장소 10 μL. 100 μm의 깊이 hemacytometer에 fluoroscein 혼합물의 피펫 10 μL. 4,096분의 1,000 전체 이미지 강도를 조정합니다. 그런 차가운 – preconditioning (즉, 관심의 강도 ≥ 250 CA1 영역의 문화를 버리고) 부상을 입을 않았 확인하기 위해 슬라이스 문화의 배경 이미지를 수집합니다. NMDA 매체와 쟁반을 준비합니다. NMDA 10 MM 주식 솔루션 매주 최소한을 준비합니다. excitotoxic 부상, SFM에서 20 50 μm의에 NMDA를 희석하고 적어도 20 분 정상적인 배양 조건에 평형. 일반적인 배양 조건에서 60 분에 대한 NMDA 미디어에 BSL – 2 후드 및 무균 기술, 장소에 삽입을 사용합니다. 각 포함 10 ML의 Neurobasal가 36 ° C.에 예열 별도의 세 60mm 요리의 각 삽입 세 번 수영으로 삽입의 NMDA를 린스 세 60mm 세척 요리의 각 집합에 대한 3 개 삽입을 사용하지 마십시오. 일반적인 배양 조건에 문화를 반환합니다. 24시간 NMDA에 노출 후 부상 이미지를 수집합니다. 위의 설명 fluoroscein 표준 카메라를 보정합니다. 20 분 대한 Sytox 미디어의 장소 문화. 부상을 Quantitate : MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 CA1 지역 주변 AOI를 그립니다. 에 대해 선택한 지역의 측정 강도 "부상." 복사 및 붙여넣기 AOI '부상'에서 '배경'이미지. "부상"및 Excel에 "배경"에서 값을 입력합니다. 제어 및 콜드 preconditioned 문화 Quantitate '분자 – 배경 ". 통계 소프트웨어 (예 : SigmaStat)를 사용하여, 실험 집단 (S) 비교는 항상 각각의 실험 실행에 포함되어야 제어 그룹의 부상을 비교하기 위해 적절한 통계적 테스트를 실행합니다. 참고 : 부상 수준의 한 – 일 후 부상 이미지 낮은 경우, 휴대 아웃 둘, 셋, 일 실험. 문화의 보호는 부상을 느끼기 쉬운 상태의 부족 (그림 2)에 의한 마스크 수 있습니다. 참고 : "보호"의 문제는 우리가 측정 부상 수준과 모든 비교를 위해 비율 (그림 3)로 이동하라는 메시지가 나타납니다. 5. 콜드 preconditioning 적용된 공동 트리 트먼트 슬라이스 문화의 중요한 이점은 환경 조건이다S 정확하게 제어할 수 있습니다. 이것은 신호에서 그 시토킨을 의미 차가운 – preconditioning 것은, 측정 했었 및 중요한 노드 측면을 해부하다하기 위해 변조된 수 있습니다. 재조합 (예 : 작용제) 단백질과 중화 (예, 항체 또는 가용성 수용체) 단백질은 각각 시토킨 신호를 모방하고 조절하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 이러한 단백질은 재구성하고 적절한 bioactivity을 보장하기 위해 6 개월 이내에 사용하기 위해 -20 ° C에서 aliquots로 저장됩니다. 여기, 우리는 가용성 TNF 수용체 1 (sTNFR1)를 사용하여 TNF – α 신호 폐기의 모범적인 사용을 설명합니다. 50 μg / ML 재고, 20-50 μL 금액 나누어지는하고, -20 ° C.에 저장하기 위해 PBS에 알부민 0.1 % 소 혈청에서 Reconstitute sTNFR1 사용하기 위해, sTNFR1 200 슬라이스 문화 성장 미디어에 NG / ML은 36 기까지 희석 ° C 사전 추위 – preconditioning 20 분 sTNFR1 미디어의 적절한 슬라이스 문화. 참고 : 분산을 줄이기 위해, 그것은 대 (즉, 50 μg / ML 성장 미디어 10 ML에 sTNFR1 주식에서 1:250 희석 40 μL sTNFR1 필요) 성장 미디어의 대량 200 NG / ML sTNFR1을 희석하는 것이 가장 좋은 방법입니다 (1.1 ML 미디어 당 4.4 μL) 접시 각 물론 직접 sTNFR1을 추가. 물론 각각의 삽입에 sTNFR1 200 미디어 NG / ML 및 장소 1.1 ML를 희석. 미디어 ° C 위에서 설명한 90 분 추위 – preconditioning에 슬라이스 문화를 노출하기 전에 최소한 20 분 30 평형 수 있습니다. 다시 36시 플레이스 슬라이스 문화 ° 미디어 sTNFR1 현재와 C. 24 시간 후에, 앞에서 설명한 것처럼 20 분 Sytox 미디어 문화를 노출 그리고 그런 차가운 – preconditioning가 문화를 다친 건 아니기를 확인하기 위해 배경 이미지를 수집합니다. 위에서 설명한대로 데이터를 Quantitate. 체외에서 구성 요소 새로 고침 미디어는 모든 3-4일. 6. 콜드 preconditioning 후 즉각적이고 지연 Excitotoxic 부상 냉간 preconditioning과 함께 즉각적인 부상. 위에서 설명한대로 수행 추위 preconditioning. 냉간 preconditioning 후, 20 분 정상적인 부화하는 문화를 반환합니다. 그런 다음 한 시간 동안 20-50 μm의 NMDA 부상으로 문화를 쉽게받을 수 있습니다. 문화에게 위에서 설명한대로 세 번 씻어 정상 부화로 돌아갑니다. 위에서 설명한대로 24 시간 후에, 부상 사진을 확보. 냉간 preconditioning의 효과를 지연. 위에서 설명한대로 수행 추위 preconditioning. NMDA 부상 24 시간 후에 위에서 설명한 것처럼하는 문화를 쉽게받을 수 있습니다. 초기 보호를 모니터하는 차가운 – preconditioning 후 3 일 동안 부상 이미지를 획득하기 위해 계속합니다. 7. RNA 격리 다음과 같은 유전자 발현 과정은 단일 슬라이스 문화 결정됩니다. RNA를 안정시켜 6 웰 문화 요리 3 ML의 RNAlater로 성장 미디어 및 일반 배양에서 슬라이스 문화를 전송합니다. 최대 3 일이 4 ° C에서 보관은 아래에 설명된 처리까지. 부드럽게 감기 1 ML에서 좋은 팁 페인트 브러쉬와 장소 삽입에서 슬라이스 문화를 리프트 (4 ° C) 1.5 ML의 PBS (DNase, RNase 및 DNA 무료) microcentrifuge 관. 30 초 및 제거 PBS 뜨는에 대한 샘플을 원심 분리기. -80에서 보관 샘플 ° C. 얼음 슬라이스 문화 (~ 250 NG / EA.) 해동 샘플에서 RNA를 분리하려면 다음과 같이하십시오. 더 자세히 설명하고 RNeasy 마이크로 핸드북 (Qiagen)에서 적응하는 다음 절차를 통해 Qiagen MicroRNeasy 키트를 사용하여 RNA를 분리. 한 조각의 문화를 포함하는 각 microcentrifuge 관에 350 μL 플레이스 버퍼 RLT (ML 당 10 μL β – 메르 캅 토 에탄올을 포함). 30 초에 대한 vortexing하여 샘플을 균질. 완전 버퍼 RLT에서 균질 때까지 (즉, 조직 펠렛 계속 표시) 필요가 일회용 유봉을 사용하는 경우, 조직을 씹다. lysate 믹스와 섞어 피펫으로 70 % 에탄올 대신 350 μL. 컬렉션 튜브의 스핀 컬럼 및 장소 (스핀 열 및 수집 튜브 모두 Qiagen에서 제공하는)에 homogenate를 전송합니다. 최대 속도 15 초에 대한 샘플을 원심 분리기. 열을 보유합니다. 최대 속도 15 초 350 μL 버퍼 RW1 플러스 원심 분리기를 추가하여 스핀 컬럼을 씻으십시오. 버퍼를 폐기하십시오. 80 μL 전체 볼륨을 항복하는 RDD 70 μL 버퍼에 DNase I 주식 10 μL를 희석. 피펫 부드럽게 와동하지 혼합합니다. 샘플 당 희석 DNase 주식의 80 μL를 준비합니다. 30 분 실온에서 알을 품다. 15 초에 대한 스핀 컬럼 및 원심 분리기를 맛볼 350 μL 버퍼 RW1를 추가합니다. 수집 튜브를 폐기하십시오. 새 컬렉션의 튜브를 사용하여, 시료 500 μL 버퍼 RPE를 추가하고 원심 분리기 15 초 및 버퍼를 폐기하십시오. 2 분에 대한 예제와 원심 분리기에 80 % 에탄올 500 μL를 놓습니다. 수집 튜브를 폐기하십시오. 5 열고 관 뚜껑과 함께 최대 속도 분, 수집 튜브를 삭제하고, 키트 제공한 1.5 ML 수집 관에 전송 스핀 열의 centrifuging하여 스핀 컬럼을 건조. 스핀 열 막의 중앙에 분리된 RNA, 장소 14 μL RNase 무료 물을 수집하려면 다음과 같이하십시오. 한 분 원심 분리기와 유체를 수집합니다. 이 RNasin의 μL (TE 버퍼 1 U / μL의 희석)와 -80에서 저장 ° C. 추가 TE 버퍼 8.0 산도 10 MM 트리스 (트리스 [히드록시 메틸] aminomethane), 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (ethylenediaminetetraacetic 산성 나트륨 소금 하이드 레이트)로 구성되어 있습니다. 8. RNA의 양을 정함 참고 : RNasin는 RiboGreen 분석을 방해하지 않습니다. RNase 무료 TE 버퍼에 RiboGreen 1:200를 희석 다음과 같이. TE (ML) : 1; Ribogreen (μL) : 5; TE (ML) : 4; Ribogreen (μL) : 20; TE (ML) : 6; Ribogreen (μL) : 30. RNA 기준은 다음과 같은 준비가되어 있습니다. 효모 tRNA는 RNA 표준으로 사용됩니다. tRNA는 저장 (-20 ° C) 1 등 MG / TE 버퍼에 ML. 1 μg / ML 작업 표준 생산 (DNase, RNase 및 DNA 무료) 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 사용하여, TE 버퍼에 1 MG / ML 주식을 희석 1:100. 인접 테이블에 그림과 같이 다음 이미 판 우물의 TE 버퍼에 1 μg / ML 표준의 적절한 금액을 추가 TE 버퍼 희석제를 먼저 추가하여 직접 96 – 웰 형광 분석 판에서 표준 곡선을 준비합니다. 각 표준은 다음과 같이 위해 우물을 중복 확인하십시오. 권. STD니다. (μL) : 100; 권. 의 TE (μL) : 0; 잘에서 RNA (NG) : 100; 권. STD니다. (μL) : 80; 권. 의 TE (μL) : 20, 우물에 RNA (NG) : 80; 권. STD니다. (μL) : 60; 권. 의 TE (μL) : 40, 우물에 RNA (NG) : 60; 권. STD니다. (μL) : 40; 권. 의 TE (μL) : 60, 우물에 RNA (NG) : 40; 권. STD니다. (μL) : 20; 권. 의 TE (μL) : 80, 우물에 RNA (NG) : 20; 권. STD니다. (μL) : 0; 권. 의 TE (μL) : 0; 잘에서 RNA (NG) : 0. 분석은 다음과 같이 준비합니다. 96 잘 판의 샘플 우물 각 TE 버퍼 99 μL를 추가합니다. 이 작업을 수행하기위한 가장 효율적인 방법은 멀티채널 pipettor를 사용하는 것입니다. 실험 샘플 우물에 RNA 1 μL를 추가합니다. 잘 멀티채널 pipettor를 사용하여 각 희석 RiboGreen 100 μL를 추가하고 pipettor 중 하나 또는 두 개의 스트로크로 씹다. 480 나노미터와 520 nm의 여기 방출에서 형광 플레이트 리더에 접시를 참조하십시오. RNA 수준의 측정 형광 농도와 Microsoft Excel을 사용하여 표준 곡선을 구축. 표준 곡선에서 발생하는 선형 방정식을 사용하여 샘​​플에서 RNA의 농도를 계산합니다. 9. SYBR 그린 정량 PCR PCR 절차는 최고의 RNA (그림 4)와 함께 작업을 위해 특별히 예약된 깨끗한 지역에서 이루어집니다. 멀리 자외선, 10 %의 표백 제나 RNase와 함께 사용하기 전에 잠재적인 DNA의 오염 및 RNase 활동의 영역과 관련 실험실 장비를 오염을 제거하다. 모든 절차를 걸쳐 장갑을 착용한다. 같은 키트와 함께 제공된 모든 절차 RNase 무료로 물을 사용합니다. DEPC – (diethylpyrocarbonate) 처리된 물을 사용하지 마십시오. 즉시 외국 DNA의 저능아 에어로졸 오염을 사용 후 모든 PCR 관련 튜브를 닫습니다. 개발하고 관심의 mRNA 대상 (들)에 대한 primers를 특징. 이러한 방법 외를 헐스에 보충 방법에 대한 자세한 있습니다., 신경 과학 논문집 2008 년 13. cDNA는 iScript를 사용하여 역방향 전송을 통해 30-200 NG 총 RNA에서 생산됩니다. RNA의 수량을 시작하는 선택은 샘플의 일부 (예 : 10 % 전체의 -20 %)에서 RT – PCR 분석을 수행하는 목적으로 사용 가능한 RNA의 총 금액에 의해 결정됩니다. RNA의 나머지 큰 부분은 향후 분석을 위해 저장됩니다. iScript 키트는 무작위로 hexamers와 oligo – DT의 primers의 조화, 20 μL의 총 볼륨의 수정 MMLV 역방향 transcriptase을 활용합니다. 25 전사 수익을 거꾸로 ° C 50 분, 그리고 반대 transcriptase에 대해 42 ° C 다음 30 분 85시 5 분 ° C 이후 변성에있다. RNA 수량을 시작하기 0.4 NG / μL 상대의 최종 농도 TE 버퍼에 cDNA 희석. SYBR 녹색 PCR 기반의 전략은 cDNA 증폭하는 데 사용됩니다. PCR 반응은 SYBR 그린 설립을 모니터링하여 실시간으로 모니터링하고 있습니다. 50 μL 반응 3 MM에게 MgCl 2, 200 μm의 dNTPs, 15 pmol 순방향 및 역방향 primers 각을 포함, 1 μm의 플루오레신, 1X SYBR 녹색 염료, cDNA 10 μL (4 NG) 슬라이스 문화, 반응의 1.25 U 플래티넘 DNA 형성 촉매 효소 50 MM KCl, 10 MM 트리스, 8.3 산도 구성된 버퍼. PCR은 실시간으로 데이터를 수집할 수 iCycler의 thermocycler를 사용하여 수행됩니다. 자전거 매개 변수는 30 초 어닐링 / 확장자 (60 ° C) 45 번 반복하여 다음 15 초 변성 (95 ° C)로 이루어져 있습니다. 광학 측정은 어닐링 / 확장 단계에서 촬영하고 CT 값은 iCycler 시스템 소프트웨어를 사용하여 결정됩니다. 관심과 β – 굴지의 시토킨 대상에 대한 cDNA 표준 곡선을 만드는 데 사용됩니다. 복사 번호는 플라스미드 cDNA의 분자 무게와 질량에서 결정됩니다. 복사 번호 / 질량 표준 곡선은 각각의 분석에 건설하고 포함되어 있습니다. 각 cDNA 희석에 대한 CT 값은 복사 번호 V. CT 곡선을 결정하는 데 사용됩니다. 시토킨 및 β – 굴지 복사 번호 수준은 표준 곡선을 사용하여 샘​​플 결정됩니다. 10. Microarrays에 대한 정량 PCR 정량 실시간 qPCR 배열 검사는 낮은 수준의 염증 중재자의 표현 변경 프로브에 매우 민감하고 재현성을 의미합니다. SABiosciences에서 RT2 Profiler (프로필러) PCR 배열은 제조 업체에서 더 자세히 설명한 다음 단계로, 염증 중재자의 유전자 표현의 변화에​​ 사용됩니다. 분석은 0.1-1.0 μg의 RNA를 사용합니다. 우리는 지역 슬라이스 영역 (예 : 두 개의 풀링된 샘플 ~ 250 NG 총 RNA를 제공 CA1) 또는 총 RNA의 비슷한 금액을 포함하는 모든 단일 슬라이스를 사용하십시오. 샘플 및 제어 RNAS는 반대로 첫 번째 스트랜드 키트 (예, # C – 03)를 사용하여 cDNA로 베꼈는데 있습니다. 결과 cDNA는 SYBR 그린 기반의 PCR 믹스 (# PA – 011) 및 PCR 배열 플레이트 (84 독특한 실험 유전자와 16 가사의 유전자를 측정)의 96 우물의 각으로 aliquotted 25 μL와 혼합됩니다. 하나의 배열 판은 실험 시료 준비하고 두 번째 접시는 컨트롤에 대한 준비가되어 있습니다. 참고 : 제조 업체에서 제공한 SYBR 그린 마스터 믹스는 열 자전거 타는 사람마다 다릅니다. 열 사이클링는 95 ° 60 한 분 확장 단계 다음에 C ° C. 15 초의 변성 단계로 구성된 40주기 프로토콜 iCycler을 사용하여 수행됩니다 광학 데이터는 확장 단계에서 수집됩니다. 열 사이클링은 0.5 ° C 증가에 55-95 ° C 온도 범위를 검색 용융 곡선 분석에 의해 다음 있습니다. 치료 및 제어 접시에서 유전자의 상대적인 표현은 두 사용하여 결정되었다 – 제공된 엑셀 기반의 소프트웨어를 사용하여 ΔΔCt 방법과 배 늘리거나 컨트롤에 상대적인 감소로 표시됩니다. 표현 두 배 증가 또는 감소와 유전자가 더 평가를 위해 간주됩니다. (냉간 preconditioning에 대한 # PARN – 011A를 사용하는 예) PCR 배열 검사에서 확인된 유전자는 더 confirme 아르D는 qPCR을 사용합니다. PCR 배열은 유전자가 자극에 대한 응답으로 규제하는 식별합니다. 긍정적으로 냉간 preconditioning에 대한 응답으로 규제로 추위 – preconditioning의 예제에서, 우리는 IL – 11 유전자를 발견. 분석의 다음 단계는 새로 확인된 유전자가 위의 상세 qPCR 분석을 사용하여 슬라이스 문화에 규제 있는지 확인하는 것입니다. 11. 다중 Microsphere 흐름 Cytometric Proteomic 어세이 위에서 설명한대로 추위 – preconditioning에 슬라이스 문화를 쉽게받을 수 있습니다. 총 단백질 분석을위한 수확 슬라이스 문화. 부드럽게 한 ML 추위에 미세 팁 브러시과 장소를 사용하여 삽입에서 조각 (4 ° C) PBS. 리프트 튜브를 원심 분리기 및 슬라이스 문화에서 PBS를 제거합니다. 드라이 아이스에 대한 플레이스 수확이 완료될 때까지. -80에서 보관 튜브 ° C. 총 단백질 분석을 수행하기위한 슬라이스 문화 샘플을 균질. 균질에 대한 세포 용해 버퍼를 준비합니다. 제조 업체의 지침 (바이오 래드)에 따라, 용해 완충액 5 ML하는 프로 테아제 억제제를 추가하고 얼음에 따로 설정할 수 있습니다. 100 μL 피펫 팁있는 5 번 아래 pipetting과로 슬라이스 문화와 선동 조각에 용해 버퍼의 장소 100 μL 1 mm까지 오픈 했네요. ° C 20 분 4시 판 통에 샘플을 흔들어. 4 15 분 13,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기 ° C. 깨끗한 튜브에 뜨는 전송 및 얼음 따로 설정할 수 있습니다. 총 단백질 분석을 수행합니다. 준비 BSA (소 혈청 알부민) 단백질 표준. 제조 업체의 지침에 따라 ultrapure의 물로 Reconstitute 주식 BSA. 용해 버퍼에 희석 0000-1000 μg / ML을 이르는 단백질 표준을 준비합니다. 키트 지침에 따라 필요한 작업 시약의 볼륨을 계산합니다. 예를 들어, (8 표준 + 18 알 샘플) X (두 복제) X (샘플 당 필요한 200 μL 일하고 시약) 96 잘 microplate (예 : microsphere 흐름 cytometric 분석에로드하는 데 필요한 작업 시약의 총 볼륨의 = 10.4 ML ) 아래를 참조하십시오. 혼합 시약은 시약 A와 B, 일부 탁도가 발생할 수 있지만, 곧 사라 해야지. microplate에 10 μL 표준과 샘플을로드합니다. 우물로 일하고 시약의 0.2 ML를로드합니다. 실링 테이프로 microplate를 커버하고 30 초에 대한 판 흔드는 악수. 37 품어의 microplate ° C 30 분. 595 나노미터 파장에서 플레이트 판독기에 읽기 전에 상온에 쿨 microplate (약 10 분). BSA 표준 측정 absorbances와 Microsoft Excel을 사용하여 표준 곡선을 구축. 표준 곡선에서 발생하는 선형 방정식을 사용하여 샘​​플의 단백질 농도를 계산합니다. -80에서 용해 버퍼와 저장 ° C.로 측정한 가장 낮은 농도에 대한 모든 샘플을 희석 참조 # 12 16 완전한 세부 사항에 명시된 바와 같이 단일 플렉스와 멀티 플렉스 시토킨 조직 (또는 액체) assays을 수행합니다. 12. Immunohistochemistry 10 ML 16 % paraformaldehyde로 구성된 PLP의 정착액 24 시간 동안 문화를 수정, 1.096는 g 라이신, 0.42 g의 나트륨 인산염, 및 0.17 g의 나트륨 periodate은 ultrapure 물 (정착액은 6.2 산도 임) 80 ML의 총 볼륨으로 가득 찼다. 우리는 PLP 정착액가 달리 다른 fixatives를 사용하여 분명 않을 낮은 수준 immunostaining의 검출을 허용하는 부드러운 고정력있는 것을 찾으십시오. 문화가 24 시간 동안 고정 후 PBS가 포함된 나트륨 azide (100 MG / L)에 좋은 브러시로 전송됩니다. ~ 50 rpm으로 흔들어에 결합하여 모든 단계와 함께 다음과 같은 부동 전체 슬라이스 문화의 명시야 immunostaining이 수행됩니다. 10 분 3 ML PBS로 세 번 슬라이스 문화를 씻으십시오. 0.3 % H 2 O 2 슬라이스 문화를 끄다. PBS 30 % H 2 O 2 재고 솔루션을 희석. PBS 세 번, 10 분 각 슬라이스 문화를 씻으십시오. 10 ML 염소 혈청, 0.75 ML 트리톤 X – 100과 89.25 ML PBS로 구성된 여섯 잘 플레이트 3 ML 차단 솔루션에 실온에서 한 시간 만이라도 슬라이스 문화를 차단합니다. 차단 솔루션 세럼은 이차 항체가 자랐어요있는 동일한 종류에서 온 것입니다. 4 차단 솔루션에 희석 일차 항체의 야간 슬라이스 문화 ° C. 품어 작은 유리 Pyrex 요리 우물에 대한 기본 항체 솔루션의 최대 볼륨은 0.3 ML 높은 볼륨이 접시의 가장자리를 통해 실행하는 경향이되어야합니다. humidified 닫힌 용기에 접시를 놓습니다. 섹션이 overlying 필름에 돌다가 추가 검사 결과에 대한 손실되었을 때부터 우리는 자기편 필름으로 접시를 커버하지 않습니다. 그냥있을만큼 충분히 높은 항체 용액에 조각을 순환하는 판 뿌리의 속도를 흔들어 조정합니다. 유리 접시에서 조각을 제거하고 씻어 당 10 분 PBS로 세 번 씻어. 떨고있는 동안 한 시간 만이라도 실온에서 차 항체의 조각 품어. 0.3 ML 차 항체 솔루션을 로드할 작은 유리 Pyrex 요리를 사용합니다. PBS, 세차 당 10 분 안에 세 번 씻으십시오. 3' – diaminobenzidine (DAB)와 염색법 시각화. 3 ML 디메틸 sulfoxide 30 MG DAB를 디졸브. 필터 DAB 54 ML PBS 두 개의 # 1 여과지와 세척을 사용합니다. 즉시 사용하기 전에, 30 % H 2 O 2 20 μL를 추가합니다. 상온에서 5-7 분 DAB 솔루션에 문화를 품다. 참고 : DAB는 발암 물질이고 적절하게 폐기해야합니다. 펌 후드에 저장된 표시된 컨테이너에있는 모든 DAB 솔루션의 처분 및 DAB를 비활성화 표백 솔루션의 모든 요리를 놓으십시오. 모든 DAB 솔루션은 궁극적으로 기관 안전 사무소를 통해 폐기해야합니다. 10 분 각각에 대해 세 번 PBS에서 슬라이스 문화를 씻으십시오. 젤라틴에 젖은 마운트 슬라이스 문화 (또는 실란) 증류수에 용해 100 μL 접시 비누로 코팅 슬라이드. 실온에서 하룻밤 건조. 슬라이드 따뜻하게에게 과도한 열을 사용하지 마십시오이 슬라이드에 탑재 문화에 균열이 발생할 수 있습니다. 30 초 각각에 대한 등급 에탄올 일련의 (50, 75, 95, 95, 100, 100 %)을 통해 슬라이드를 탈수. 십 분 각 크실렌 네 번 맑은 슬라이드. 유리 파스퇴르 피펫, 장소 슬라이드 위에 장착 미디어 0.1 ML 부드럽게 형성 공기 방울을 피하기 위해 coverslip을 사용합니다. 실온에서 하룻밤 건조. 형광등 immunostaining. 섹션 슬라이스 문화 그라 이오 스탯을 사용하여 두께 20 μm의 수 있습니다. ° C 내부 온도 및 -12 ° C에 대한 개체 온도 -16에 그라 이오 스탯 설정을 조정합니다. 파스퇴르 피펫과 드라이 아이스에 대한 동결을 사용하여 금속 척에 물을 소량 넣습니다. 냉동 척 위에 조직 테크 미디어의 얇은 디스크 계층을 적용합니다. 척은 동결하고 그라 이오 스탯 챔버 온도 평형 수 있습니다. 섹션 조직 테크 미디어 평면 슬라이스 문화를 세우고 적합한 평평 표면을 만들 수 있습니다. 이 sectioning하면 척 떨어지에서 설치 미디어를 방지할 것을 sectioning에 대한 일관성있는 각도를 제공하면서 척의 방향을 확인합니다. 냉동 때, 밖으로 척하고 홀더에 열립니다. 금속 주걱과 미세 팁 페인트 브러쉬를 사용하여, 주걱에 한 조각 문화를 슬라이드와로 전송척에서 조직 테크 미디어의 평평 레이어의 중간. 적어도 10 분 챔버 온도에 탑재된 슬라이스 문화와 동결을 통해 조직 테크 미디어의 얇은 레이어를 놓습니다. "균형"버튼을 활성화 섹션 슬라이스 문화까지 조직 테크 미디어의 상단에 레이어로 표시됩니다. 20 μm의에서 "섹션"사전에 "트림"에서 전환합니다. 하룻밤 상온 건조 슬라이드 아르 젤라틴 코팅 슬라이드 20 μm의 섹션을 픽업. 조직 테크 미디어 슬라이드에서 볼 수 있지만, PBS의 세척에 해소됩니다. Immunostaining. 10 분 각각에 대해 세 번 PBS로 슬라이드를 씻으십시오. 0.3 % 떨고 실온에서 15 분에 대한 H 2 O 2에 끄다. 10 분 각각에 대해 세 번 PBS로 슬라이드를 씻으십시오. SFX 신호 향상제를 사용하여 직접 humidified 챔버에 실온에서 30 분 슬라이드 및 부화에 대한 섹션 위에 구성 요소의 몇 방울을 적용합니다. 구성 요소와 부화는 명시야 immunohistochemistry에서 수행한 10 % 염소 혈청 솔루션으로 차단 단계를 대체합니다. 기본 항체에 품어 슬라이드 0.75 %에서 37 두 시간 동안 PBS에서 트리톤 X – 100 ° C.를 희석 슬라이드 상단에 직접 일차 항체 솔루션을 적용하고 증발을 방지하기 위해 humidified 챔버에 품어. 단 PBS 그리고 Triton X – 100을 사용하는 항체 솔루션의에서 혈청 포함되지 않습니다. 10 분 각각에 대해 세 번 PBS로 슬라이드를 씻으십시오. 실온에서 한 시간 만이라도 차 항체에 부화하고 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다. 항체 용액에 들어가기에서 모든 집계를 방지하기 위해 20 분 모든 형광 보조 항체를 원심 분리기. PBS의 트리톤 X – 100 0.75 %를 사용하여 항체 dilutions를 준비합니다. 10 분 각각에 대해 세 번 PBS로 슬라이드를 씻으십시오. 딥는 PBS에서 염분을 씻어 한 번 증류수에 슬라이드. , 실온에서 하룻밤 건조 슬라이드 빛으로부터 멀리 있었다. Coverslip는 Antifade 미디어를 연장과 함께 슬라이드. 해동 구성 요소 5-10 초위한 전자 레인지에 A와 B는 용액에 공기 방울을 소개하지 않도록주의하고, Pastuer의 피펫을 사용하여 서로 혼합 구성 요소의 유리병에 약 1 ML를 추가합니다. 거품을 제거하는 최대 속도에서 5 분 원심 분리기. 모든 기포를 생성하지 않도록주의 Pastuer 피펫을 사용하여 슬라이드의 맨 연장 미디어의 얇은 레이어를 적용합니다. 부드럽게 빛이 멀리 적용 슬라이드의 상단과 하룻밤 건조에 커버 슬립을 놓으십시오. 두 번 라벨 형광 Immunostaining (그림 5). 동일한 배양 용액에 기본 항체 모두 희석 제외하고 위에서 설명한 형광 Immunostaining을 수행합니다. 동일한 솔루션에있는 모든 보조 항체를 희석하고 위에 설명된대로 알을 품다. 이 항체를 사용하여 직렬 부화 기간이 저하 immunostaining 결과. 13. 대표 결과 그림 1. hippocampal 슬라이스 문화와 microglia의 모습. 왼쪽 이미지는 전형적인 성숙 (즉, 체외 21 일) hippocampal 슬라이스 문화의 주요 뉴런의 cytoarchitecture을 설명하기 NeuN (녹색)와 얼룩 보여줍니다. 피라미드 뉴런은 지역 CA1과 CA3 및 덴트에 표시됩니다왼쪽 이랑 (DG) 뉴런을 먹었어요. 스케일 바 250 μm의 수 있습니다. 오른쪽 이미지는 CA1 영역에서 파생된 및 성숙 슬라이스 문화 이내 정지 microglia의 브랜츠드 품질을 설명하기 위해 높은 전력 표시됩니다. 세포 표면 마커 microglial, cd11b로 표시했습니다. 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다. 그림 2. 콜드 – preconditioning hippocampal 슬라이스 문화에 neuroprotection합니다. 문화는 Sytox 그린, 형광 표시 죽은 세포 마커와 incubated 있습니다. 맨 윗줄은 가짜 제어 문화를 보여 주며 하단 행은 ° C 90 분 28 노출 슬라이스를 보여줍니다. 왼손, 사전 화면의 이미지는 CA1 부상을 표시하지 않습니다. 상대 부상 컬러 보정 규모는 왼쪽 상단에 이미지로 표시됩니다. 중간 행 이미지는 24 시간 20 μm의 NMDA에 노출 후 상대 슬라이스 문화 부상을 보여줍니다. 가짜 제어 부상 감기 – preconditioning (CP)에 노출 문화의보다 큰 것을 확인할 수 있습니다. 전통적으로, 문화 그 다음, CA1의 연결을 부상 수준 및 CP 대 가짜의 상대적인 부상을 최대화하기 위해 밤새 NMDA 20 μm의 노출 부상 / 최대한 부상의 비율로 설명되어 있습니다. 하지만, 최대한의 부상 자극에 노출 preconditioning에서 neuroprotection를 극복하기 위해 충분하지 않을 수 있습니다. 따라서, 정확하게 preconditioning neuroprotection에서 반영되지 않을 수 있습니다 상해 / 상해 최대한의 비율 중 하나를 사용하십시오. 이것은 CP 최대한의 수준은 가짜 컨트롤보다 저렴 표시 오른쪽 이미지에 분명하다. 그림 3. 개략도에서 부상 수준을 quantitate하는 초기, 첫날 측정을 사용하는 유틸리티를 보여주는 차가운 – preconditioning 실험을. 위에서 언급한 것처럼, 우리는 추위에 미리 에어컨에서 neuroprotection을 가리 수 비율 (상해 / 최대한의 부상)의 사용을 발견했습니다. 이것은 도식에서 가짜 부상은 빨간색으로 표시됩니다 왼쪽에있는 그리고 볼 수 후 파란색으로 추위 preconditioning. 어느날 NMDA 노출 후 차가운 – preconditioning은 40 %의 neuroprotection와 일치 부상 V. 사기 ( "5") 컨트롤의 상대 "3"수준을 보여줍니다. 비율 (예, 부상 / 최대한의 부상)를 사용하여 전통적인 형식을 사용하는 경우에는, 아무런 보호 분명하지 않습니다 [추위에 preconditioning에 대한 예 (5 / 10) = 가짜 V. (3 / 6) 50 % = 50% ]. 그림 4. Typial qPCR 결과가 표시됩니다. 컨트롤 (파란색)과 실험 샘플 (빨간색)를 보여주는 PCR의 증폭에 대한 어퍼 곡선 RNA 사본 번호 V. 임계값주기를. 하단 이미지 네 샘플 (검정, 녹색, 노란색과 보라색)에 대한 전형적인 증폭 프로필을 보여줍니다. 후자 CT 임계값 사이클이 (오렌지 라인으로 표시), 26.0에서 29.5, 31.0 및 32.5 발생 공지. 그림 5. 두 번 라벨 immunostaining은 qPCR와 qPCR 배열 결과를 확인하는 데 사용 슬라이스 문화 IL – 11 (적색)와 NeuN (녹색, 뉴런을 표시하는)에 대한 처리되었습니다. IL – 11의 세포 표현 loci에 대해 조사합니다. astrocytes로 추정 몇 가지 작은 세포 (화살표), 표시하면서 일부 피라미드 뉴런이 (화살표) IL – 11와 NeuN의 얼룩을 (노랑) 표시되는 공지 사항은 IL – 11 염색법 (적색) 증가했다.